隨著技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩方面的提升,。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面,，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造,。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深,。關(guān)于標(biāo)本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問題,，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理,。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解,，讓標(biāo)本“透明度”提高,。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細(xì)孔,，提高了熒光檢測(cè)效率。美國熒光雙光子顯微鏡熒光探測(cè)

雙光子顯微鏡(2PM)可以對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進(jìn)行亞細(xì)胞分辨率的成像,，從而測(cè)量不透明腦深部的活動(dòng),。成像膜的電壓變化可以直接反映神經(jīng)元的活動(dòng)，但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來說太快了,。目前,，電壓成像主要由寬視場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn)，但其空間分辨率較差,，且只能在淺深度成像,。因此，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化,，需要將成像速率提高2PM,。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時(shí)間延遲的聚焦陣列,。然后,，該模塊被集成到一個(gè)帶有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示,。光源是重復(fù)頻率為1MHz的920nm激光器,。FACED模塊可以產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，脈沖時(shí)間間隔為2ns,。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,。虛光源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點(diǎn)越小,。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡，從而在X軸上產(chǎn)生0.82m和0.35m的橫向分辨率,。ultimainvestigator雙光子顯微鏡廠家電話雙光子顯微鏡結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡,。

配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效,。那么什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí)，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后,，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）,。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù),。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光,，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光,，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收,，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果,。

配合雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí),，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）,。利用這個(gè)原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù),。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光,，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收,，從而能夠達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果,。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì),。

雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光子，經(jīng)過短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后,，發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子,；效果和用波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優(yōu)點(diǎn)是具有更深的組織穿透深度,，紅外光可以在平面上探測(cè)到極限為1mm的組織區(qū)域,；因?yàn)樾盘?hào)背景比高，所以具有更高的對(duì)比度,；由于激發(fā)體積小,，具有定點(diǎn)激發(fā)、光毒性小的特點(diǎn),；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，更加安全,。雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器,。進(jìn)口ultima雙光子顯微鏡掃描深度

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    其實(shí)電子顯微鏡相比于光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢(shì)或者存在的比較大意義,，準(zhǔn)確的來說,，不在于放大倍數(shù)，而在于超高的分辨率,。這兩者是不同的,。通俗的來說，就是進(jìn)行觀察的時(shí)候,，除了要將物體放大,，還需要能將它與相鄰的其他物體分辨開來。如果兩個(gè)相鄰微粒的圖像在光學(xué)顯微鏡下,，即使放大到很大,，看到的可能卻是兩個(gè)相交的亮斑（艾里斑），而沒有明顯的界限（更不用說細(xì)節(jié)了）,，這表示是分辨率不夠,。拋開分辨率談放大倍數(shù)是沒有意義的。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限,，約等于光波波長(zhǎng)的一半,，通常被說成是光學(xué)顯微鏡放大極限，其實(shí)準(zhǔn)確地來說,，應(yīng)該叫做分辨率的極限,。而其產(chǎn)生的原因是光的衍射,，根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實(shí)驗(yàn)證明了電子的波動(dòng)性,，于是用電子代替光的電子顯微鏡成為可能,。電子顯微鏡也有多種，題主說的是像REM的,。電鏡也存在用衍射規(guī)則觀察的,，比如低能電子衍射（LEED）和透射電鏡（TEM）。兩者主要用于觀察晶體,，根據(jù)其周期性的特點(diǎn)而生成倒易空間里的衍射圖像,，借助elward球或者傅里葉變換就可以轉(zhuǎn)換到實(shí)空間，得到真正的晶體表面圖像了,。 美國熒光雙光子顯微鏡熒光探測(cè)