相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西,，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢,？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎,？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點,、***觀察,！由于電磁波的波長越短，粒子性越強,，受散射影響也就越大,。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性,。除此之外,，因為只有物鏡焦點處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高,，也能提高激發(fā)光效率,，減少被掃描點之外的熒光物質(zhì)消耗。雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器,。國外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡分辨率是多少

2008年錢永健等人由于熒光蛋白（GFP,，綠色熒光蛋白）的發(fā)現(xiàn)和使用，獲得了諾貝爾化學(xué)獎,，是對熒光成像技術(shù)的一次巨大肯定和推動,。與熒光蛋白以及熒光染料等標記物在細胞中的定位與表達技術(shù)相結(jié)合，使得科學(xué)家可以特異性的分辨生物體乃至細胞內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)與成分,，并且能夠在生命體和細胞仍具有活性的狀態(tài)下（狀態(tài)）對其功能進行動態(tài)觀察,。這就使得熒光成像技術(shù)成為了無可替代的，生物學(xué)家現(xiàn)今較為重要的技術(shù)手段之一,。目前,，大多數(shù)細胞生物學(xué)和生理學(xué)研究主要還是在離體培養(yǎng)的細胞體系中研究。然而與細胞生物學(xué)研究有所不同的是,，大腦的功能研究的整體性和原位性顯得更加關(guān)鍵：只研究分離的神經(jīng)元無法解釋神經(jīng)系統(tǒng)的功能和規(guī)律,。由于被觀測的信號會受到樣本組織的散射和吸收，根本無法穿透如此深的組織進行成像,。而雙光子顯微鏡（Two-photonMicroscopy,，簡稱TPM）的發(fā)明,，則為此類研究帶來了希望。雙光子顯微鏡圖像對比度雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用,，可以觀察細胞內(nèi)的亞細胞結(jié)構(gòu),、蛋白質(zhì)分布、細胞活動等,。

TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纖激光器是一種易于操作且無需維護的激光系統(tǒng),。其輸出波長為920nm，非常適合常規(guī)熒光基團（如GFP,，eGFP,，Eosin，GCaMP,，CFP,，Calcein或者Venus）的雙光子激發(fā)。能給熒光基團提供比較高的峰值功率,，常用于神經(jīng)科學(xué)和其他與激光有關(guān)的生物光子學(xué)學(xué)科,。而且其獨特設(shè)計（制造簡單且經(jīng)濟高效的光源）對雙光子熒光顯微鏡發(fā)展的革新具有潛在的可能。在雙光子顯微鏡中,，峰值功率就是亮度,！如果您希望獲得比較好的圖像亮度，那么你就需要短脈沖,，高功率,，較重要的是需要干凈的時間脈沖形狀。FemtoFiberultra920具有足夠高的輸出功率,，較短的脈沖和獨特的Clean-Pulse技術(shù),，以及具有相對比較高的峰值功率，使得其在雙光子顯微鏡中可以實現(xiàn)****的亮度,，而不會對樣品造成不必要的加熱,。FemtoFiberultra920交鑰匙，完全集成的色散補償（可確保樣品處的脈沖較短）,，內(nèi)置的功率控制,，操作直觀以及其堅固而緊湊的設(shè)計，使該系統(tǒng)具有極為友好的用戶體驗,，是非線性顯微鏡應(yīng)用的較好解決方案,。例如熒光蛋白的雙光子激發(fā)和基于SHG的對比機制。

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),，早在20多年前就有了,，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子**過期后,，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上,。即便如此,，世界上很多實驗室都搭雙光子，自己搭的好處有很多,，首先是便宜,，尤其是實驗室已經(jīng)有飛秒激光器，那就更很省錢了,。其次是靈活，可以選擇針對特殊用途的搭配,，改動也靈活,。結(jié)束后的好處就是可以鍛煉隊伍，一趟走下來可以把新手帶出來,，后期維護也更加自由,。當然壞處也不少，首先是操心,，特別是第1次搭的時候,，開始要想方案，后來要解決各種實際問題,。其次是花時間,，加上買配件的時間，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章,，各種protocol，大多是老外寫的,，中文的較少,。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的，尤其是沒有經(jīng)驗的時候,，容易走彎路,，多花錢，也多花時間,，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買,，在國內(nèi)買這些東西耗時較長。因此,，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗,，貼出來分享，希望能幫到想自己動手的實驗室雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進行有生命體成像,。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像,，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對比圖,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達到250到500微米,，甚至超過1毫米。另外,，同時吸收兩個光子意味只有較強度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像,。雙光子顯微鏡品牌有哪些,？國外investigator雙光子顯微鏡代理商

雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細胞進行特定實驗；國外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡分辨率是多少

在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子,，然后發(fā)射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（如下圖）,。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時,，可采用750nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響,。國外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡分辨率是多少