光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡本質(zhì)的區(qū)別在于，光學(xué)顯微鏡：用的是可見光電子顯微鏡：用的是高頻電子射波有什么區(qū)別，在于一個基本的原理,，光的衍射,。。,。光波是一個有趣的東西，其中有一項，如果物體的體積小于光的波長,，光一般可以繞過去，不發(fā)生明顯變化,。也就是說,，有這個物體和沒這個物體，在這種情況下,，光是不會發(fā)生明顯改變的,。可見光的波長（肉眼）：380～780納米,，也就是,，如果比380納米還要小的東西，用光學(xué)顯微鏡,，無論你放大多少倍,，也是看不見的。因為光繞過去了,。,。。光的衍射為了克服這個問題,，科學(xué)家用波長更短的光去照射物體,，也是就被觀測物。比如10納米級的光,，這樣,，就能看到我們用肉眼無論如何都看不見的東西。這就是電子顯微鏡多說一句,，光速是不變的,。光速=頻率×波長,。波長越短，頻率越大,。,。頻率越大，光波的能量越大,。這就是為什么電子顯微鏡的功率越大,，能看到的東西越小。顏色取決于物體能反射光的波長的長短當(dāng)你看到的物體小于較小可見光的波長,，那它就是沒有顏色的,。。,。因為顏色是肉眼對于可見光頻率在大腦中的投影,。。,。,。所以只能把他們統(tǒng)一變?yōu)楹诎住?。,。沒有顏色不是透明的意思,，它們不是肉眼可見顏色的定義中包含的,。優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)。國外investigator雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆穿透能力強：相對于紫外光,，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題,；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點處，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象,；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦），這樣就提高了對熒光的收集率,，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高,。進(jìn)口2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細(xì)胞進(jìn)行特定實驗；

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。下面是兩種技術(shù)的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米,，甚至超過1毫米,。另外，同時吸收兩個光子意味只有較強度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像。

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測體內(nèi)神經(jīng)元信號,，這是揭示動物神經(jīng)活動復(fù)雜機制的關(guān)鍵,。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動,；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動,，目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進(jìn)行成像,，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示,。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns,。這些焦點是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用,。

雙光子顯微鏡(2PM)可以對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進(jìn)行亞細(xì)胞分辨率的成像,，從而測量不透明腦深部的活動,。成像膜的電壓變化可以直接反映神經(jīng)元的活動，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快了,。目前,，電壓成像主要由寬視場顯微鏡實現(xiàn)，但其空間分辨率較差,，且只能在淺深度成像,。因此，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化,，需要將成像速率提高2PM,。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時間延遲的聚焦陣列,。然后,，該模塊被集成到一個帶有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示,。光源是重復(fù)頻率為1MHz的920nm激光器,。FACED模塊可以產(chǎn)生80個脈沖焦點，脈沖時間間隔為2ns,。這些焦點是虛擬源的圖像,。虛光源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點越小,。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡，從而在X軸上產(chǎn)生0.82m和0.35m的橫向分辨率,。在深度組織中以較長時間對細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。進(jìn)口2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

雙光子顯微鏡知多少,。國外investigator雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)

雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度,，利用紅外光,，能夠在層面檢測極限達(dá)1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高,，而具有更高的對比度,；因激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全,。國外investigator雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)