在多光子顯微鏡（也稱為非線性或雙光子顯微鏡）中，以兩倍正常激發(fā)波長照射樣品,。更長的波長是有利的,，因為它們可以更深地穿透樣品進行3D成像，并且因為它們不會損壞樣品,，從而延長樣品壽命,。為了實現(xiàn)多光子激發(fā)，照明光束在空間上聚焦（使用光學(xué)器件）,，同時使用高能短脈沖激發(fā)光束以提高兩個（或更多）光子同時到達同一位置（即熒光團分子）的概率,。多光子顯微技術(shù)的例子包括二次諧波產(chǎn)生(SHG)、三次諧波產(chǎn)生(THG),、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)和受激發(fā)射耗盡(STED)顯微技術(shù),。由于這些技術(shù)中的每一種都使用脈沖激光器，因此選擇能夠比較大限度地減少脈沖色散的光學(xué)組件很重要,，并且激光反射二向色鏡應(yīng)具有低GDD特性,。多光子激光掃描顯微鏡是建立在激光掃描顯微鏡技術(shù)基礎(chǔ)上的實驗方法，三維觀察上提供更的光學(xué)切片能力,。美國靈長類多光子顯微鏡三維分辨率

多束掃描技術(shù)可以同時對神經(jīng)元組織的不同位置進行成像對兩個遠距離（相距大于1-2mm）的成像部位,，通常使用兩條單獨的路徑進行成像；對于相鄰區(qū)域,，通常使用單個物鏡的多光束進行成像,。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_問題，這個問題可以通過事后光源分離方法或時空復(fù)用方法來解決,。事后光源分離方法指的是用算法來分離光束消除串?dāng)_,；時空復(fù)用方法指的是同時使用多個激發(fā)光束，每個光束的脈沖在時間上延遲,，這樣就可以暫時分離被不同光束激發(fā)的單個熒光信號,。引入越多路光束就可以對越多的神經(jīng)元進行成像，但是多路光束會導(dǎo)致熒光衰減時間的重疊增加,，從而限制了區(qū)分信號源的能力,；并且多路復(fù)用對電子設(shè)備的工作速率有很高的要求；大量的光束也需要更高的激光功率來維持近似單光束的信噪比,，這會容易導(dǎo)致組織損傷,。熒光多光子顯微鏡實驗全球多光子顯微鏡主要消費地區(qū)分析，包括消費量及份額等,。

當(dāng)細胞受到外界刺激時,，隨著刺激時間的增加，即使繼續(xù)刺激,，Ca2+熒光信號也不會繼續(xù)增強,，反而會減弱,，直至恢復(fù)到無刺激時的水平。對于細胞受精過程中Ca2+熒光信號的變化,，發(fā)現(xiàn)粘附過程中Ca2+熒光信號沒有變化,，但當(dāng)配子融合時，Ca2+熒光信號強度出現(xiàn)一個不穩(wěn)定的峰值,，持續(xù)數(shù)分鐘,。這些現(xiàn)象對于研究受精發(fā)育的早期信號以及Ca2+在卵子和受精卵發(fā)育中的作用具有重要意義。在其他生理過程中,，如細胞分裂和胞吐,，Ca2+熒光信號的強度也會發(fā)生很大的變化。

對于雙光子成像而言,，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素,，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號,。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描,，以便及時采樣神經(jīng)元活動,；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號,。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來,，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動,，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學(xué),，就需要MPM具備對神經(jīng)元進行快速成像的能力,。快速MPM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù),。多光子顯微鏡銷售渠道分析及建議,。

針對雙光子熒光顯微鏡的特點，從理論上分析雙光子成像特點,，并搭建一套時間,、空間分辨率高，能實時,、動態(tài),、多參數(shù)測量的雙光子熒光顯微鏡系統(tǒng)。具體系統(tǒng)應(yīng)實現(xiàn)∶（1）能對不同染料的雙光子熒光進行探測;（2）用特定染料對樣品標(biāo)記以后，能實現(xiàn)雙光子熒光的三維成像;（3）通過實驗的研究,，改進雙光子熒光顯微成像系統(tǒng);（4）在保證成像質(zhì)量的前提下,，簡化整個系統(tǒng)，使得實驗操作方便,、安全,。單光子激發(fā)熒光的過程，就是熒光分子吸收一個光子,，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后,，能量較大的激發(fā)態(tài)分子,，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級,。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級像在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像研究中顯示了較大的優(yōu)勢,。而在顯微成像中，雙光子熒光顯微鏡憑其獨有的優(yōu)點,，成為研究細胞結(jié)構(gòu)和功能檢測的重要工具,。顯微鏡簡史：從光到多光子顯微鏡。美國高速高分辨率多光子顯微鏡Ultima Investigator

多光子顯微鏡能提供多種對比度機制,。美國靈長類多光子顯微鏡三維分辨率

2020年,，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）,。圓柱透鏡將激光束一維聚焦,，會聚角為Δθ。光束進入到一對幾乎平行的高反射鏡中,，其間距為S,，偏角為α。經(jīng)過反射鏡多次反射后,，激光脈沖被分成多個傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α）,，脈沖間以2S/c的時間延遲（c，光速）回射,。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns,。這些焦點是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡,，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。美國靈長類多光子顯微鏡三維分辨率