2020年,，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學顯微鏡中，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度。近年來，通過使用遠程聚焦技術(shù)或電調(diào)諧透鏡(ETL)已經(jīng)實現(xiàn)了快速軸向掃描,。但遠程對焦時對反射鏡的機械驅(qū)動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球差和高階像差，無法進行高分辨率成像,。為了克服這些限制，該小組引入了一種新的光學設計,，可以將橫向掃描轉(zhuǎn)換為無球面像差的軸向掃描,，以實現(xiàn)高分辨率成像。有兩種方法可以實現(xiàn)這種設計。***個可以執(zhí)行離散的軸向掃描,，另一個可以執(zhí)行連續(xù)的軸向掃描,。如圖3a所示，特定裝置由兩個垂直臂組成,，每個臂具有4F望遠鏡和物鏡,。遠程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成，另一個臂(稱為照明臂)由浸沒物鏡(OBJ2)組成,。兩個臂對齊,，使得GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛。準直后的激光束經(jīng)偏振分束器反射進入遠程聚焦臂,，由GSM進行掃描,，使OBJ1產(chǎn)生的激光焦點可以進行水平掃描。多光子顯微鏡的大多數(shù)補償器都采用棱鏡,。美國高速高分辨率多光子顯微鏡系統(tǒng)

單束掃描技術(shù)可以高速遍歷大視場（FOV）的神經(jīng)組織：使用MPM對神經(jīng)元進行成像時,，通過隨機訪問掃描—即激光束在整個視場上的任意選定點上進行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標記的神經(jīng)纖維,，還可以優(yōu)化激光束的掃描時間,。隨機訪問掃描（圖1）可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實現(xiàn)，其原理是將具有一個射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上,，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵,，激光束通過光柵時發(fā)生衍射。通過射頻電信號調(diào)控聲波的強度和頻率從而可以改變衍射光的強度和方向,，這樣使用1個AOD就可以實現(xiàn)一維橫向的任意點掃描,，利用1對AOD，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實現(xiàn)3D的隨機訪問掃描,。但是該技術(shù)對樣本的運動很敏感,，易出現(xiàn)運動偽影。目前,，快速光柵掃描即在FOV中進行逐行掃描,，由于利用算法可以輕松解決運動偽影而被普遍的使用。清醒動物多光子顯微鏡Ultima 2P Plus多光子激光掃描顯微鏡更能解決生物組織中深層物質(zhì)的層析成像問題, 擴大了應用范圍,。

Ca2+是重要的第二信使,，對于調(diào)節(jié)細胞的生理反應具有極其重要的作用，開發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對Ca2+熒光信號進行觀測,，可以從某些方面對有機體或細胞的變化機制進行分析,，具有重要的意義。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細胞內(nèi)用熒光探針標記的Ca2*的時間和空間的熒光圖像的變化,，還可以觀察細胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化,。通過對單細胞的研究發(fā)現(xiàn),，Ca2+不僅在細胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的，而且細胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差,。

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細胞分辨率下監(jiān)測體內(nèi)神經(jīng)元信號,，這是揭示動物神經(jīng)活動復雜機制的關(guān)鍵。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測量不透明大腦深處的活動,；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快,。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn),，但它的空間分辨率較差并且于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進行成像,，需要明顯提高2PM的成像速率,。多光子顯微鏡可以進行深層成像，且具有三維成像的能力,，可以應用于拍攝不透明的厚樣品,。

基于多光子顯微鏡的神經(jīng)成像技術(shù)原理：多光子顯微鏡可用于深度成像和三維成像，因此可用于拍攝不透明的厚樣品,。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡,。雙光子顯微鏡的結(jié)構(gòu)與共焦類似，區(qū)別在于：1)雙光子顯微鏡的激發(fā)光波長比共焦長,，能量較低,，但穿透能力較強；2)雙光子顯微鏡沒有小孔,，提高了檢測效率,；3)雙光子顯微鏡成像深度較快提高。那么,，為什么雙光子能具有共焦顯微鏡所沒有的優(yōu)勢呢,？原因是它采用雙光子激發(fā)方式。使用波長較長的激發(fā)光子,，光子的能量較低,，因此電子需要吸收兩個這樣的激發(fā)光子才能達到激發(fā)態(tài)，從而釋放出一個熒光光子,。因此,，熒光信號的強度與光強的平方成正比。因為焦點處的光強較大,，只能在焦點處激發(fā)熒光,。波長越長，穿透力越強,，因此雙光子顯微鏡的成像深度大于共焦顯微鏡,。由于兩個光子只在焦點激發(fā)熒光，不需要小孔,，而是將所有的熒光都收集起來,，提高了檢測效率。三光子顯微鏡的原理類似于雙光子顯微鏡,，利用三個激發(fā)光子可以實現(xiàn)更深的成像深度,。由于使用了更長的激發(fā)波長，穿透能力更強,，成像深度更大,。此外，由于較強的非線性效應,，熒光信號的強度與光強的立方成正比,，因此比雙光子具有更低的非聚焦激發(fā)和背景噪聲。雙光子顯微鏡采用長波長激發(fā),。美國靈長類多光子顯微鏡

帶寬足以覆蓋鈦藍寶石激光器的可調(diào)諧范圍和用于多光子顯微鏡的許多其它激光器的典型中心頻率,。美國高速高分辨率多光子顯微鏡系統(tǒng)

對于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素,，而對于三光子成像這兩個問題大大減小,，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號,。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高,，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經(jīng)元活動,；需要更高的脈沖能量,，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號。復雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡,，該網(wǎng)絡既具有局部的連接又具有遠程的連接,。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動,，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激,，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學，就需要MPM具備對神經(jīng)元進行快速成像的能力,?？焖費PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。美國高速高分辨率多光子顯微鏡系統(tǒng)