新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成功研制是國家重大科研儀器研制專項(xiàng)的一個(gè)碩果,。它彰顯了北京大學(xué)在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域先期布局的前瞻性，鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體,、具有學(xué)科交叉背景和重要技術(shù)創(chuàng)新能力的“中國智造”隊(duì)伍,。目前，該研發(fā)團(tuán)隊(duì)正在領(lǐng)銜建設(shè)“多模態(tài)跨尺度生物醫(yī)學(xué)成像”十三五國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施,，積極參與即將啟動(dòng)的中國腦科學(xué)計(jì)劃,。可以期待，微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)將為實(shí)現(xiàn)“分析腦,、理解腦,、模仿腦”的戰(zhàn)略目標(biāo)發(fā)揮不可或缺的重要作用雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行指標(biāo)成像；美國ultima雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商

WinfriedDenk使用的第1個(gè)光源是染料飛秒激光(脈沖寬度100fs,，可見光波長630nm),。染料激光雖然實(shí)驗(yàn)室演示可以接受，但是使用起來不方便,，所以離商業(yè)化還很遠(yuǎn),。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)光源變成了飛秒鈦寶石激光器。鈦寶石激光器除了具有固態(tài)光源的優(yōu)點(diǎn)外,，還具有近紅外波長調(diào)諧范圍寬,，而近紅外比可見光穿透更深，對生物樣品的損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)左側(cè)。從雙光子到三光子科學(xué)家們正在從雙光子顯微鏡轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk的導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博時(shí)發(fā)明了三光子顯微鏡。如果雙光子吸收是可行的,，那么三光子似乎是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長的波長，大約1.3和1.7微米,，成像深度比雙光子更深,。目前錄音大約2.2毫米，人的大腦皮層厚度大約4毫米,。與雙光子顯微鏡相比,，三光子需要使用更強(qiáng)、更短,、重復(fù)率更低的激光脈沖,，這是傳統(tǒng)的鈦寶石激光器很難滿足的，但對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)就非常容易,。國外2PPLUS雙光子顯微鏡原理顯微成像技術(shù)包含：雙光子顯微鏡、寬場熒光顯微鏡,、共聚焦顯微鏡,、全內(nèi)反射熒光顯微鏡等多種成像方式。

隨著技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點(diǎn),，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。深要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面,，大致可從兩個(gè)方面入手,，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細(xì),，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深,。關(guān)于標(biāo)本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問題,，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高,。高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞,，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒,，而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫，這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,，又能不損傷細(xì)胞,，使掃描能更好地進(jìn)行。

通過對顯微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計(jì),，將FHIRM-TPM2.0的成像視場擴(kuò)展至420×420平方微米,，顯微物鏡的工作距離擴(kuò)展至1mm，實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)成像,。嵌入可拆卸的快速軸向掃描模塊,，實(shí)現(xiàn)深度180微米的三維體成像和多平面快速切換的實(shí)時(shí)成像。該模塊由一個(gè)快速電動(dòng)變焦鏡頭和一對中繼鏡頭組成,，在不同深度成像時(shí)保持放大率恒定,。其中，變焦模塊重1.8克,，科研人員可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求自由拆卸,。此外，新型微型成像探頭可以瞬間插拔,，極大簡化了實(shí)驗(yàn)操作,，避免了長時(shí)間實(shí)驗(yàn)對動(dòng)物的干擾,。反復(fù)裝卸探針追蹤同批神經(jīng)元時(shí)，視場旋轉(zhuǎn)角度小于0.07弧度,，邊界偏差小于35微米,。雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用，可以觀察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白質(zhì)分布,、細(xì)胞活動(dòng)等。

通過并行化不同激光波長的激光掃描,，研究人員增加了在相同時(shí)間內(nèi)可以成像的體積,，同時(shí)保持了高的時(shí)間和空間分辨率。研究人員通過引入兩種不同波長的鈣信號(hào)熒光探針,，將神經(jīng)元群體的活動(dòng)標(biāo)記為兩種不同的顏色,，同時(shí)激發(fā)兩種不同波長的探針，從而實(shí)現(xiàn)了兩種顏色的并行數(shù)據(jù)記錄,。為了實(shí)現(xiàn)三維空間成像,，研究人員還在兩個(gè)激光束上配置了快速變焦系統(tǒng)，即一個(gè)電透鏡和一個(gè)空間光調(diào)制器,。因此,，可以以10Hz的速度同時(shí)記錄10個(gè)500微米和500微米的平面，覆蓋600微米的深度,，覆蓋大腦皮層第二層到第五層的結(jié)構(gòu),，體積內(nèi)可以記錄2000多個(gè)神經(jīng)元。雙光子顯微鏡還可以對一些具有特性的染料細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，還有一些短波長可以利用雙光子特性進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn),。國外2PPLUS雙光子顯微鏡原理

由于其非侵入性和高分辨率的特點(diǎn)，雙光子顯微鏡成為了研究神經(jīng)科學(xué),、ai癥研究,、免疫學(xué)等領(lǐng)域的重要工具。美國ultima雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商

配合雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效,。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子使電子躍遷到較高能級(jí)，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后,，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長為長波長一半的光子（P=h/λ）,。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù),。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再次穿過物鏡,，被光探頭接收,，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。美國ultima雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商