雙光子顯微鏡工作原理是將超快的紅外激光脈沖傳輸?shù)綐悠分?，在樣品中與組織或熒光標(biāo)記相互作用,，這些組織或熒光標(biāo)記發(fā)出用于創(chuàng)建圖像的信號。雙光子顯微鏡被多用于生物學(xué)研究,，因為它能夠產(chǎn)生高分辨率的3-D圖像,，深度達1毫米。然而,，這些優(yōu)點帶來了有限的成像速度,，因為微光條件需要逐點圖像采集和重建的點檢測器。為了加快成像速度,，科學(xué)家之前開發(fā)了一種多焦點激光照明方法,，該方法使用數(shù)字微鏡設(shè)備(DMD)，這是一種通常用于投影儀的低成本光掃描儀,。此前人們認(rèn)為這些DMD不能與超快激光一起工作,。然而現(xiàn)在解決了這個問題，這使得DMD在超快激光應(yīng)用中得以應(yīng)用,，這些應(yīng)用包括光束整形,、脈沖整形、快速掃描和雙光子成像,。DMD在樣品內(nèi)隨機選擇的位置上產(chǎn)生5到30點聚焦激光,。 全球多光子顯微鏡主要生產(chǎn)地區(qū)分析，包括產(chǎn)量,、產(chǎn)值份額等,。布魯克多光子顯微鏡單分子成像定位

針對雙光子熒光顯微鏡的特點，從理論上分析雙光子成像特點,，并搭建一套時間,、空間分辨率高，能實時,、動態(tài),、多參數(shù)測量的雙光子熒光顯微鏡系統(tǒng)。具體系統(tǒng)應(yīng)實現(xiàn)∶（1）能對不同染料的雙光子熒光進行探測;（2）用特定染料對樣品標(biāo)記以后,，能實現(xiàn)雙光子熒光的三維成像;（3）通過實驗的研究,，改進雙光子熒光顯微成像系統(tǒng);（4）在保證成像質(zhì)量的前提下,，簡化整個系統(tǒng)，使得實驗操作方便,、安全,。單光子激發(fā)熒光的過程，就是熒光分子吸收一個光子,，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),，躍遷以后，能量較大的激發(fā)態(tài)分子,，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子,，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級像在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像研究中顯示了較大的優(yōu)勢,。而在顯微成像中,，雙光子熒光顯微鏡憑其獨有的優(yōu)點，成為研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能檢測的重要工具,。清醒動物多光子顯微鏡成像精度多光子顯微鏡涉及醫(yī)學(xué),、生物學(xué)、化學(xué),、物理學(xué),、電子學(xué)、工程學(xué)等學(xué)科,，生產(chǎn)工藝相對復(fù)雜,，進入門檻較高。

    與傳統(tǒng)的單光子寬場熒光顯微鏡相比,，多光子顯微鏡(MPM)具有光學(xué)切片和深度成像的功能,，極大地促進了研究人員對整個大腦深部神經(jīng)的認(rèn)識。2019年,，JeromeLecoq等從腦深部神經(jīng)元成像,、大數(shù)量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像三個方面討論了相關(guān)的MPM技術(shù),。為了將神經(jīng)元活動與復(fù)雜行為聯(lián)系起來,，通常需要對大腦皮層深處的神經(jīng)元進行成像，這就要求MPM具備深度成像的能力,。激發(fā)光和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收,，這是限制MPM成像深度的主要因素。雖然增加激光強度可以解決散射問題,，但會帶來其他問題,，如燒焦樣品、散焦和近表面熒光激發(fā),。增加MPM成像深度的比較好方法是使用更長的波長作為激發(fā)光,。另外,，對于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素,，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小,，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號,。

多光子顯微鏡對成像深度的改善利用紅光或紅外光激發(fā),，光散射小（小粒子的散射與波長的四次方的成反比）,。不需要***,，能更多收集來自成像截面的散射光子。***不能區(qū)分由離焦區(qū)域或焦點區(qū)發(fā)射出的散射光子,，多光子在深層成像信噪比好,。單光子激發(fā)所用的紫外或可見光在光束到達焦平面之前易被樣品吸收而衰減，不易對深層激發(fā),。多光子熒光成像的特點。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對厚散射物質(zhì)成像,。信噪比∶多光子吸收采用的波長是單光子吸收的2倍以上,，所以顯微試樣中的瑞利散射更小，熒光測定的信噪比更高,。觀察活細(xì)胞∶離子測量（i.e.Ca2+）,，GFP，發(fā)育生物學(xué)等—減少了光毒性和光漂白,，能對細(xì)胞長時間觀察,。多光子顯微鏡技術(shù)是對完整組織進行深層熒光成像的優(yōu)先技術(shù)。

雙光子熒光顯微成像主要有以下優(yōu)點∶a.光損傷小∶雙光子熒光顯微鏡使用可見光或近紅外光作為激發(fā)光,，對細(xì)胞和組織的光損傷很小,，適合于長時間的研究;b.穿透能力強∶相對于紫外光，可見光或近紅外光具有很強的穿透性,，可以對生物樣品進行深層次的研究;c．高分辨率∶由于雙光子吸收截面很小P,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為λ范圍內(nèi);d.漂白區(qū)域很小,，焦點以外不發(fā)生漂白現(xiàn)象,。e．熒光收集率高。與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器,，提高了熒光收集率。收集效率提高直接導(dǎo)致圖像對比度提高,。f.對探測光路的要求低,。由于激發(fā)光與發(fā)射熒光的波長差值加大以及自發(fā)的三維濾波效果,，多光子顯微鏡對光路收集系統(tǒng)的要求比單光子共焦顯微鏡低得多，光學(xué)系統(tǒng)相對簡單,。g.適合多標(biāo)記復(fù)合測量,。許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜要比單光子激發(fā)譜寬闊，這樣,，可以利用單一波長的激發(fā)光同時激發(fā)多種染料,，從而得到同一生命現(xiàn)象中的不同信息，便于相互對照,、補充,。世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國和日本，德國是徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司,。離體多光子顯微鏡成像精度

多光子顯微鏡被認(rèn)為是,、完整生物組織成像的手段之一，其成像尺度從分子級別到整個有機體,。布魯克多光子顯微鏡單分子成像定位

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比,，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個優(yōu)勢極大地促進了研究者們對于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識,。2019年,，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像,、高速神經(jīng)元成像這三個方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)[1],。想要將神經(jīng)元活動與復(fù)雜行為聯(lián)系起來，通常需要對大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進行成像,，這就要求MPM具有深層成像的能力,。激發(fā)和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強度來解決散射問題,，但這會帶來其他問題,，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā),。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光,。布魯克多光子顯微鏡單分子成像定位