多光子激發(fā)掃描顯微成像系統(tǒng)的不足,。只能對(duì)熒光成像。如果樣品包括能夠吸收激發(fā)光的色團(tuán),，如色素,，樣品可能受到熱損傷。分辨率略有降低,，雖然可以通過(guò)同時(shí)利用共焦的小孔得到改善,，但是信號(hào)會(huì)有損耗。受昂貴的超快激光器限制,，多光子掃描顯微鏡的成本較高,。多光子激發(fā)顯微鏡應(yīng)用舉例。動(dòng)物和腦片神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能,、動(dòng)物腦皮層的成像,、胚胎發(fā)育過(guò)程的長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)、多光子激發(fā)光解籠,、細(xì)胞內(nèi)微區(qū)鈣動(dòng)力學(xué),、多光子激發(fā)自發(fā)熒光、其它應(yīng)用,。多光子顯微鏡銷(xiāo)售/營(yíng)銷(xiāo)策略建議,。美國(guó)共聚焦多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測(cè)體內(nèi)神經(jīng)元信號(hào)，這是揭示動(dòng)物神經(jīng)活動(dòng)復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵,。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測(cè)量不透明大腦深處的活動(dòng)；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng),，但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來(lái)說(shuō)太快,。目前電壓成像主要通過(guò)寬場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對(duì)膜電壓變化進(jìn)行成像,，需要明顯提高2PM的成像速率。美國(guó)模塊化多光子顯微鏡研究多光子顯微鏡的發(fā)展現(xiàn)狀及未來(lái)發(fā)展趨勢(shì),。

通過(guò)添加FACED模塊,，可以將基于標(biāo)準(zhǔn)振鏡的現(xiàn)有2PM輕松轉(zhuǎn)換為千赫茲成像系統(tǒng)。FACED雙光子熒光顯微鏡遵循光柵掃描,，需要很少的計(jì)算處理,，在稀疏或密集的標(biāo)記樣本中均可以使用，并且不受串?dāng)_的影響，而且對(duì)整個(gè)圖像平面采樣后可以進(jìn)行運(yùn)動(dòng)校正,。實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有觀(guān)察到光損傷的跡象,，此外，子脈沖延遲到達(dá)相同的樣品位置,，能為熒光團(tuán)提供充足的時(shí)間使其從易于破壞的暗態(tài)返回到基態(tài),，可以明顯減少光漂白。使用現(xiàn)有的傳感器,，F(xiàn)ACED雙光子熒光顯微鏡可以提供足夠的速度和靈敏度來(lái)檢測(cè)神經(jīng)元過(guò)程中的鈣瞬變和谷氨酸瞬變,，以及來(lái)自細(xì)胞體的尖峰和亞閾值電壓。該組使用基于FACED的2PM顯微鏡,，在小鼠大腦中實(shí)現(xiàn)了千赫茲速率的神經(jīng)活動(dòng)成像,。在物鏡平均激光功率為10-85mW下，他們測(cè)量了清醒小鼠中V1神經(jīng)元的自發(fā)性和感覺(jué)誘發(fā)性的超閾值和亞閾值電位活動(dòng),。

從產(chǎn)品類(lèi)型及技術(shù)方面來(lái)看,，正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場(chǎng)。2020年,，全球多光子激光掃描正置顯微鏡市場(chǎng)達(dá)到87.30百萬(wàn)美元,，預(yù)計(jì)到2027年該部分市場(chǎng)將達(dá)到154.02百萬(wàn)美元，年復(fù)合增長(zhǎng)率（2021-2027）為8.48%,。中國(guó)多光子激光掃描正置顯微鏡市場(chǎng)達(dá)到13.32百萬(wàn)美元,，預(yù)計(jì)到2027年該部分市場(chǎng)將達(dá)到25.21百萬(wàn)美元，年復(fù)合增長(zhǎng)率（2021-2027）為9.58%,。從產(chǎn)品市場(chǎng)應(yīng)用情況來(lái)看,，研究機(jī)構(gòu)為主要應(yīng)用領(lǐng)域，2020年約占全球市場(chǎng)46.28%,。2020年,，全球多光子激光掃描顯微鏡研究機(jī)構(gòu)應(yīng)用消費(fèi)量為174臺(tái)，預(yù)計(jì)2027年達(dá)到349臺(tái),，2021-2027年復(fù)合增長(zhǎng)率（CAGR）為9.72%,。多光子激光掃描顯微鏡采用波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紅外激光,能量脈沖式激發(fā),紅外光比可見(jiàn)光在生物組織中的穿透力更強(qiáng)。

針對(duì)雙光子熒光顯微鏡的特點(diǎn),，從理論上分析雙光子成像特點(diǎn),，并搭建一套時(shí)間、空間分辨率高,，能實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài),、多參數(shù)測(cè)量的雙光子熒光顯微鏡系統(tǒng),。具體系統(tǒng)應(yīng)實(shí)現(xiàn)∶（1）能對(duì)不同染料的雙光子熒光進(jìn)行探測(cè);（2）用特定染料對(duì)樣品標(biāo)記以后，能實(shí)現(xiàn)雙光子熒光的三維成像;（3）通過(guò)實(shí)驗(yàn)的研究，改進(jìn)雙光子熒光顯微成像系統(tǒng);（4）在保證成像質(zhì)量的前提下,，簡(jiǎn)化整個(gè)系統(tǒng),，使得實(shí)驗(yàn)操作方便、安全,。單光子激發(fā)熒光的過(guò)程,，就是熒光分子吸收一個(gè)光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),，躍遷以后,，能量較大的激發(fā)態(tài)分子，通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周?chē)姆肿?，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí),。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí)像在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像研究中顯示了較大的優(yōu)勢(shì)。而在顯微成像中,，雙光子熒光顯微鏡憑其獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn),，成為研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能檢測(cè)的重要工具。多光子激光掃描顯微鏡已經(jīng)成為了一個(gè)活躍且多產(chǎn)的領(lǐng)域,。美國(guó)嚙齒類(lèi)多光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)操作

多光子顯微鏡的發(fā)展歷史充滿(mǎn)了貢獻(xiàn),、開(kāi)發(fā)、進(jìn)步和數(shù)個(gè)世紀(jì)以來(lái)多個(gè)來(lái)源和地點(diǎn)的改進(jìn),。美國(guó)共聚焦多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進(jìn)步,，特別是隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型,，為在體研究基因表達(dá)規(guī)律,、分子間的相互作用、細(xì)胞的增殖,、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),、誘導(dǎo)分化、細(xì)胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件,。然而,，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法，已經(jīng)對(duì)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了深入,、細(xì)致的研究,，但仍然不能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),。在細(xì)胞的生理過(guò)程中,，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá),、修飾和相萬(wàn)作用往往發(fā)生可逆的,、動(dòng)態(tài)的變化,。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化，但獲取這些信息對(duì)與研究基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要,。因此,，發(fā)展能用于、動(dòng)態(tài),、實(shí)時(shí),、連續(xù)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的方法非常必要。美國(guó)共聚焦多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位