為了驗(yàn)證動(dòng)物生物樣品的時(shí)間分辨成像能力,，本實(shí)驗(yàn)觀察了活海拉細(xì)胞高爾基體中的青色熒光蛋白mTFP1，見(jiàn)圖3(a),(c)-(i),。使用的物鏡及尺寸與熒光顆粒成像一致,，對(duì)比可見(jiàn)v2PE在空間分辨率、激發(fā)深度級(jí)圖像對(duì)比度較常規(guī)寬場(chǎng)顯微鏡都有所提高,。此外,，v2PE可以同時(shí)激發(fā)多個(gè)波長(zhǎng)的熒光蛋白，這種技術(shù)還可以應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)分子的三維動(dòng)力學(xué)多色成像,。在此基礎(chǔ)上,，實(shí)驗(yàn)對(duì)海拉細(xì)胞中的高爾基體(mTFP1)和纖顫蛋白(EGFP)進(jìn)行了在體成像，見(jiàn)圖3(j)-(n),，青色為mTFP1,綠色為EGFP,，實(shí)驗(yàn)中兩種熒光蛋白同時(shí)成像，終采用光譜分離法將不同蛋白的熒光信號(hào)分離出來(lái),。雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點(diǎn),，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢？國(guó)內(nèi)ultimainvestigator雙光子顯微鏡供應(yīng)商

從雙光子到三光子：科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來(lái)也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米,，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。國(guó)內(nèi)雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么雙光子顯微鏡不需要共聚焦，提高了熒光檢測(cè)效率,。

微型化雙光子熒光顯微成像改變了在自由活動(dòng)動(dòng)物中觀察細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方式,，可用于在動(dòng)物覓食、哺乳,、跳臺(tái),、打斗、嬉戲,、睡眠等自然行為條件下,，或者在學(xué)習(xí)前、學(xué)習(xí)中和學(xué)習(xí)后,，長(zhǎng)時(shí)程觀察神經(jīng)突觸,、神經(jīng)元、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),、遠(yuǎn)程連接的腦區(qū)等多尺度,、多層次動(dòng)態(tài)變化。該成果在2016年底美國(guó)神經(jīng)科學(xué)年會(huì),、2017年5月冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會(huì)議上報(bào)告后,，得到包括多位諾貝爾獎(jiǎng)獲得者在內(nèi)的國(guó)內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)家的高度贊譽(yù)。冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會(huì)議,、美國(guó)明顯神經(jīng)科學(xué)家加州大學(xué)洛杉磯分校的Alcino J Silva教授在評(píng)述中寫道,，“從任何一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看，這款顯微鏡都了一項(xiàng)重大技術(shù)發(fā)明,，必將改變我們?cè)谧杂苫顒?dòng)動(dòng)物中觀察細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方式,。它所開(kāi)啟的大門，甚至超越了神經(jīng)元和樹(shù)突成像,。系統(tǒng)神經(jīng)生物學(xué)正在進(jìn)入一個(gè)新的時(shí)代,，即通過(guò)對(duì)細(xì)胞群體中可辨識(shí)的細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜生物學(xué)事件進(jìn)行成像觀測(cè)，從而更加深刻地理解進(jìn)化所造就的大腦環(huán)路實(shí)現(xiàn)復(fù)雜行為的重要工程學(xué)原理,。毫無(wú)疑問(wèn),，這項(xiàng)非凡的發(fā)明讓我們向著這一目標(biāo)邁進(jìn)了一步,。”

王愛(ài)民副教授結(jié)合工作實(shí)例,，展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應(yīng)用,。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡,，重量只為2.2克,，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過(guò)程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)清晰、穩(wěn)定的圖像,，該顯微鏡適于佩戴在小動(dòng)物頭部,，可實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動(dòng)態(tài)信號(hào),，在大型動(dòng)物上,，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè),。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景,，首先雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像，在亞微米級(jí)成像,，此功能與目前市場(chǎng)上的共聚焦類顯微鏡性能類似,；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r(shí)、在體,、原位,、無(wú)創(chuàng)地，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性,，區(qū)分成像；雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行生化指標(biāo)成像,，在無(wú)造影劑的前提下,，利用自發(fā)熒光、二次諧波,、熒光獲得活細(xì)胞生化信息,。雙光子顯微鏡非常適合對(duì)細(xì)胞組織進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間在體成像。

光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡本質(zhì)的區(qū)別在于,，光學(xué)顯微鏡：用的是可見(jiàn)光電子顯微鏡：用的是高頻電子射波有什么區(qū)別,，在于一個(gè)基本的原理，光的衍射,。,。。光波是一個(gè)有趣的東西,，其中有一項(xiàng),，如果物體的體積小于光的波長(zhǎng)，光一般可以繞過(guò)去，不發(fā)生明顯變化,。也就是說(shuō),，有這個(gè)物體和沒(méi)這個(gè)物體，在這種情況下,，光是不會(huì)發(fā)生明顯改變的,。可見(jiàn)光的波長(zhǎng)（肉眼）：380～780納米,，也就是,，如果比380納米還要小的東西，用光學(xué)顯微鏡,，無(wú)論你放大多少倍,，也是看不見(jiàn)的。因?yàn)楣饫@過(guò)去了,。,。。光的衍射為了克服這個(gè)問(wèn)題,，科學(xué)家用波長(zhǎng)更短的光去照射物體,，也是就被觀測(cè)物。比如10納米級(jí)的光,，這樣,，就能看到我們用肉眼無(wú)論如何都看不見(jiàn)的東西。這就是電子顯微鏡多說(shuō)一句,，光速是不變的,。光速=頻率×波長(zhǎng)。波長(zhǎng)越短,，頻率越大,。。頻率越大,，光波的能量越大,。這就是為什么電子顯微鏡的功率越大，能看到的東西越小,。顏色取決于物體能反射光的波長(zhǎng)的長(zhǎng)短當(dāng)你看到的物體小于較小可見(jiàn)光的波長(zhǎng),，那它就是沒(méi)有顏色的。,。,。因?yàn)轭伾侨庋蹖?duì)于可見(jiàn)光頻率在大腦中的投影。,。,。,。所以只能把他們統(tǒng)一變?yōu)楹诎住?。,。沒(méi)有顏色不是透明的意思，它們不是肉眼可見(jiàn)顏色的定義中包含的,。雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行光裂解,、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱。美國(guó)ultimainvestigator雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

雙光子顯微鏡知多少,。國(guó)內(nèi)ultimainvestigator雙光子顯微鏡供應(yīng)商

后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用碘化丙啶(PI)來(lái)指示細(xì)胞在7,、8、9和10分鐘的延時(shí)觀察后的損傷情況,，來(lái)驗(yàn)證該光學(xué)系統(tǒng)對(duì)活細(xì)胞長(zhǎng)期觀察的適用性,。在觀察期間，88個(gè)焦點(diǎn)以100毫秒的曝光時(shí)間,，曝光間隔1s照射樣品,，激發(fā)強(qiáng)度為3.21×104W/cm2，激發(fā)波長(zhǎng)為525nm,，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑,，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖，(e)-(h)為相應(yīng)的相應(yīng)襯度圖,。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s,，得到相應(yīng)的(i)-(p)。由圖像可知,，延時(shí)觀察小于8分鐘的情況下不造成可見(jiàn)細(xì)胞損傷,，對(duì)于實(shí)際3D延時(shí)成像，由于焦平面是移動(dòng)的,，所以預(yù)期細(xì)胞存活時(shí)間會(huì)更長(zhǎng),，可見(jiàn)這是一種在3D在體延時(shí)成像中具有很大優(yōu)勢(shì)的成像方案。國(guó)內(nèi)ultimainvestigator雙光子顯微鏡供應(yīng)商