2008年錢永健等人由于熒光蛋白（GFP，綠色熒光蛋白）的發(fā)現(xiàn)和使用,，獲得了諾貝爾化學獎，是對熒光成像技術(shù)的一次巨大肯定和推動,。光學成像本身具有高分辨率,、高通量、非侵入和非毒性等特點,，再與熒光蛋白以及熒光染料等標記物在細胞中的定位與表達技術(shù)相結(jié)合,，使得科學家可以特異性的分辨生物體乃至細胞內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)與成分，并且能夠在生命體和細胞仍具有活性的狀態(tài)下（狀態(tài)）對其功能進行動態(tài)觀察,。這就使得熒光成像技術(shù)成為了無可替代的,，生物學家現(xiàn)今較為重要的技術(shù)手段之一。目前,，大多數(shù)細胞生物學和生理學研究主要還是在離體培養(yǎng)的細胞體系中研究,。然而與細胞生物學研究有所不同的是，大腦的功能研究的整體性和原位性顯得更加關(guān)鍵：只研究分離的神經(jīng)元無法解釋神經(jīng)系統(tǒng)的功能和規(guī)律,。由于被觀測的信號會受到樣本組織的散射和吸收,，根本無法穿透如此深的組織進行成像。而雙光子顯微鏡（Two-photonMicroscopy,，簡稱TPM）的發(fā)明,，則為此類研究帶來了希望。雙光子顯微鏡特有的非線性光學特性,，再加上其工作波長處在紅外區(qū)域等特點,，令其在生物體組織內(nèi)的穿透深度較大提高，使得雙光子顯微鏡成為神經(jīng)科學家進行神經(jīng)成像較理想的工具,。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器,。進口investigator雙光子顯微鏡商家

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短激發(fā)態(tài)后,，發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。因其光損傷小,、樣本透射深等優(yōu)勢,，使得觀察熒光細胞成為可能。中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所-雙光子顯微鏡成像平臺借助于雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的***成像研究,。以小鼠顱內(nèi)***成像為優(yōu)勢,，可動態(tài)**觀察小鼠顱內(nèi)神經(jīng)細胞、小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞,、周細胞,、血管、轉(zhuǎn)移瘤細胞,、膠質(zhì)瘤細胞等的變化情況,，在**學、神經(jīng)生物學,、發(fā)育生物學,、神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。小鼠其它組織臟器,，如脾,、肺、顱骨,、股骨,、胸骨等也可借助本平臺進行成像研究。美國熒光雙光子顯微鏡分辨率雙光子顯微鏡除了可以進行厚的組織樣品拍攝以外呢,，可以在小鼠的的任何部位進行成像,。

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢,？答案是否定的,，任何事物都有優(yōu)缺點，何況一臺儀器呢,，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品,，對于厚的或者樣品不能進拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描,，對樣品的光毒性還是比較大的,，特別是拍攝活細胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅；3. 由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面,，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確,；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發(fā)，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗,，效率非常低,。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有 100 飛秒,，而其周期可以達到 80至100兆赫茲。

相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西,，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子,，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢？它能做到什么普通光學顯微鏡做不到的事情嗎,？原來,，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、***觀察,！由于電磁波的波長越短，粒子性越強,，受散射影響也就越大,。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性,。除此之外,，因為只有物鏡焦點處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高,，也能提高激發(fā)光效率,，減少被掃描點之外的熒光物質(zhì)消耗。顯微成像技術(shù)包含：雙光子顯微鏡,、寬場熒光顯微鏡,、共聚焦顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡等多種成像方式,。

系統(tǒng)示意圖如圖1所示,，紅外激光束從藍寶石激光器出射后，由一個光學參量振蕩器（OPO）轉(zhuǎn)化到可見光波段,，產(chǎn)生的可見光脈沖寬度為200 fs, 重復(fù)頻率80 MHz,，波長在490-750nm范圍內(nèi)可調(diào)諧。光束通過透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中,，形成用于熒光激發(fā)的多焦點光束,。多焦點光束通過一個硅油浸潤的物鏡成像到樣品上,，激發(fā)熒光信號。熒光信號由同一個物鏡收集并傳輸?shù)疥嚵袌A盤,，產(chǎn)生共焦效應(yīng),，隔離來自焦平面外的雜散光。雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢,？國內(nèi)ultimainvestigator雙光子顯微鏡供應(yīng)商

雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點,，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢？進口investigator雙光子顯微鏡商家

雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡,，其原理大致是這樣的：首先,，讓我們來看看什么是熒光顯微鏡。熒光顯微鏡是以紫外線為光源,，照射被檢物體上的熒光物質(zhì)或是熒光染料,，使其發(fā)出熒光。相比普通光學顯微鏡,，熒光顯微鏡運用了波長更短的紫外線,，再將可見光過濾掉，提高了分辨力率,。而當被檢物體過厚時,，從不同深度發(fā)出的熒光都會打在物鏡上，使觀察到的像模糊,、發(fā)虛,，無法清楚的知道被檢物體的結(jié)構(gòu)。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上,，增加了激光掃描裝置,，從而解決了上述問題。進口investigator雙光子顯微鏡商家