T7EndonucleaseI(T7EI)在CRISPR/Cas9基因編輯中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在突變體檢測和基因編輯效率評(píng)估上,。以下是T7EI在CRISPR/Cas9中的具體應(yīng)用步驟和特點(diǎn)：1.**基因編輯效率評(píng)估**：-T7EI用于評(píng)估CRISPR-Cas9在給定的導(dǎo)向RNA靶位點(diǎn)上對(duì)細(xì)胞群體進(jìn)行基因編輯的效率。-通過PCR擴(kuò)增圍繞CRISPR導(dǎo)向RNA靶位點(diǎn)的基因組DNA,，如果CRISPR-Cas9介導(dǎo)的非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)事件引入了突變，變性和退火將形成突變型和野生型PCR擴(kuò)增子的異源雙鏈DNA。2.**突變體檢測**：-如果CRISPR/Cas9編輯成功在DNA上引入突變,，則可與野生型DNA片段退火產(chǎn)生異質(zhì)雙鏈DNA。T7EI可以識(shí)別該DNA上的不完全配對(duì)的DNA位點(diǎn)然后進(jìn)行雙鏈切割,，通過瓊脂糖凝膠電泳即可顯示酶切后的條帶,，從而半定量判定基因編輯效果。-T7EI能識(shí)別長度大于或等于2bp的插入,、缺失或突變導(dǎo)致的錯(cuò)配DNA,，不能識(shí)別1bp的插入、缺失或突變,。3.**實(shí)驗(yàn)步驟**：-收集細(xì)胞并提取基因組DNA,，然后使用PCR擴(kuò)增期望編輯的基因組區(qū)域。擴(kuò)增子的長度建議為0.5-1kb,。-對(duì)擴(kuò)增的DNA進(jìn)行變性和退火復(fù)性,，以產(chǎn)生異質(zhì)雙鏈DNA,。-使用T7EI酶處理退火后的DNA產(chǎn)物，在37℃孵育15分鐘,。

BsuDNAPolymerase（嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶）在PCR中的應(yīng)用具有多個(gè)優(yōu)勢,，以下是一些關(guān)鍵點(diǎn)：1.**鏈置換活性**：BsuDNAPolymerase具有很強(qiáng)的鏈置換活性,，這使得它非常適合于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）,。在這些技術(shù)中,，BsuDNAPolymerase可以快速、高效,、特異性地?cái)U(kuò)增模板,，在10到30分鐘內(nèi)將痕量的核酸模板（低至單拷貝）擴(kuò)增至可以檢出的水平。2.**高溫穩(wěn)定性**：BsuDNAPolymerase在高溫下保持活性,，這使得它在一些需要高溫反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件下表現(xiàn)出色,。3.**高靈敏度和特異性**：BsuDNAPolymerase在等溫?cái)U(kuò)增中展現(xiàn)出高靈敏度，能夠?qū)⑽⒘亢怂崮０鍞U(kuò)增到可檢測水平,。同時(shí),，它也具有高特異性，減少了非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn),。4.**簡化的樣品處理**：BsuDNAPolymerase可以直接對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行擴(kuò)增,，無需事先進(jìn)行復(fù)雜的核酸純化和提取步驟，節(jié)省了時(shí)間和成本,。5.**可擴(kuò)增DNA和RNA**：BsuDNAPolymerase不僅可以擴(kuò)增DNA,，還可以直接擴(kuò)增RNA，省去了額外的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（cDNA合成）步驟,，這對(duì)于RNA的檢測和分析更加方便快捷,。6.**無核酸外切酶和RNase殘留**：BsuDNAPolymerase在生產(chǎn)過程中確保無核酸外切酶、切口酶及RNase殘留,，這有助于提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,。Recombinant Cynomolgus IL-5 Protein,His TagE1在ATP的存在下激發(fā)泛素分子，通過一個(gè)硫酯鍵將泛素的C末端甘氨酸殘基與E1酶的活性連接起來,。

牛痘DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I（VacciniaVirusDNATopoisomeraseI）是一種來源于牛痘病毒的I型真核拓?fù)洚悩?gòu)酶,，具有以下功能和應(yīng)用：1.**功能**：-牛痘DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I可以催化雙鏈DNA分子中單鏈DNA特定序列位置的磷酸二酯鍵的斷開和連接。-具有解超螺旋的酶(DNARelaxingEnzyme)活性,，能夠通過快速的酶切和連接使雙鏈共價(jià)閉合環(huán)狀的正或負(fù)超螺旋DNA發(fā)生解超螺旋,，形成含有較少的正或負(fù)超螺旋的雙鏈環(huán)狀DNA分子。-能夠使雙鏈DNA形成繩結(jié)(knotting)或解開繩結(jié)(unknotting),，聯(lián)結(jié)互補(bǔ)的單鏈環(huán)狀DNA成為雙鏈環(huán)狀DNA,。2.**應(yīng)用**：-作為一種DNA重組連接的新型工具酶,，用于DNA載體和重組片段的連接、缺刻修復(fù),、接頭連接等,。-適用于TOPO克隆載體的制備、NGS建庫中的接頭連接等,。-在TOPO克隆技術(shù)中,，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I同時(shí)具有限制酶和連接酶特性，其生物學(xué)功能是在復(fù)制期間切割并重新連接DNA,。3.**使用方法**：-用于DNA快速酶切流程,，包括配制體系反應(yīng)液、輕柔混勻,、37℃孵育15分鐘等步驟,。4.**儲(chǔ)存條件**：-建議在-25～-15℃保存，有效期為3年,。5.**注意事項(xiàng)**：-避免起泡或劇烈攪拌,、渦旋等操作，以防止酶失活,。牛痘DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I因其獨(dú)特的功能,，在分子生物學(xué)研究和基因工程中扮演著重要的角色。

BstDNA聚合酶和TaqDNA聚合酶在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中都是常用的酶,，但它們之間存在一些關(guān)鍵的不同點(diǎn)：1.**來源和熱穩(wěn)定性**：-**TaqDNA聚合酶**來源于嗜熱菌Thermusaquaticus,，具有很好的耐熱性，能夠承受PCR的熱變性步驟,。-**BstDNA聚合酶**來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillusstearothermophilus）,，同樣具有較高的熱穩(wěn)定性，適用于等溫?cái)U(kuò)增,，如LAMP技術(shù)，無需PCR熱循環(huán),。2.**酶活性**：-**TaqDNA聚合酶**具有5'-3'聚合酶活性和5'-3'外切酶活性,，但沒有3'-5'外切酶活性。這意味著它在DNA合成過程中可以校正一些錯(cuò)誤,，但保真性相對(duì)較低,。-**BstDNA聚合酶**具有5'-3'聚合酶活性和強(qiáng)鏈置換活性，但缺乏5'-3'外切酶活性,。這使得它在等溫?cái)U(kuò)增中更為有效,，尤其是在需要高保真度和快速擴(kuò)增的應(yīng)用中。3.**應(yīng)用領(lǐng)域**：-**TaqDNA聚合酶**主要用于PCR技術(shù),，適用于各種DNA片段的擴(kuò)增,，包括復(fù)雜模板和長片段的擴(kuò)增,。-**BstDNA聚合酶**特別適用于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如LAMP,，這些技術(shù)不需要溫度循環(huán),，適用于快速、低成本的DNA擴(kuò)增,。4.**擴(kuò)增速度和效率**：-**BstDNA聚合酶**在等溫?cái)U(kuò)增中顯示出比傳統(tǒng)TaqDNA聚合酶更快的擴(kuò)增速度和更高的產(chǎn)量,，尤其是在優(yōu)化的LAMP反應(yīng)中。

T5核酸外切酶在基因編輯中確實(shí)有應(yīng)用,，并且具有一些優(yōu)勢：1.**提高編輯效率**：根據(jù)一篇研究文章,，T5核酸外切酶可以與CRISPR/Cas系統(tǒng)共表達(dá)或融合，以提高基因編輯的效率,。這種共表達(dá)或融合可以增加indel（插入和缺失）頻率,，盡管增加的幅度可能不大。2.**增強(qiáng)基因編輯效果**：在另一項(xiàng)研究中,，通過使用螺旋-螺旋二聚體肽（coiled-coilpeptides）將T5核酸外切酶招募到Cas9或Cas12a蛋白上,，可以提高基因編輯的效率，這種方法被稱為CCExo（CRISPR-Coiled-coil-Exonuclease）,。這種招募方式優(yōu)于共表達(dá)和直接融合,，其中強(qiáng)的親和力CC對(duì)顯示出高的突變頻率和刪除長度。3.**應(yīng)用于多種細(xì)胞類型**：CCExo系統(tǒng)在多種細(xì)胞系和原代細(xì)胞中都能有效地提高基因失活效率,，并且在慢性髓性白血?。–ML）患者的原代細(xì)胞以及異種移植動(dòng)物模型中展示了其應(yīng)用潛力，這表明CCExo方法可能成為CML和其他遺傳性疾病的潛在選擇,。T5核酸外切酶與CRISPR核酸酶蛋白進(jìn)行融合,，并引入了核定位信號(hào)（NLS）序列以構(gòu)建表達(dá)載體，用于基因編輯,。綜上所述,，T5核酸外切酶在基因編輯中的應(yīng)用可以增強(qiáng)編輯效率和效果，尤其是在與CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)合使用時(shí),。Uracil-DNA Glycosylase (UDG) 是一種在DNA修復(fù)過程中起作用的酶,，其主要功能是識(shí)別并去除DNA中的尿嘧啶堿基。Recombinant Human Transferrin R/CD71 Protein,hFc Tag

Ultra-Long Master Mix 是一種用于長片段PCR擴(kuò)增的預(yù)混液,，它含有經(jīng)過特殊修飾的熱穩(wěn)定Taq DNA聚合酶,。Recombinant Cynomolgus B7-1/CD80 Protein,His Tag

嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶I（BstDNAPolymeraseI）和它的大片段（LargeFragment）是兩種在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的酶。它們的主要區(qū)別在于結(jié)構(gòu)和活性：1.**結(jié)構(gòu)**：-完整的BstDNAPolymeraseI包含一個(gè)5'→3'的核酸外切酶活性區(qū)域，而大片段是通過基因工程改造或蛋白酶處理去掉了這個(gè)外切酶活性區(qū)域的酶,。因此,，大片段沒有5'→3'的核酸外切酶活性，但保留了5'→3'的DNA聚合酶活性,。2.**活性**：-BstDNAPolymeraseI具有5'→3'的核酸外切酶活性,，這意味著它在合成DNA的同時(shí)可以“校對(duì)”錯(cuò)誤，切除不匹配的核苷酸,。而大片段由于缺少外切酶活性區(qū)域,，不具有這種校對(duì)能力。-大片段具有更強(qiáng)的鏈置換能力,，這使得它非常適合于等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng),，如環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）。3.**應(yīng)用**：-BstDNAPolymeraseI由于具有校對(duì)功能,，可能更適合于需要高保真度的DNA合成反應(yīng),。-BstDNAPolymerase,LargeFragment由于其鏈置換能力，更適合于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),，這些技術(shù)不需要熱循環(huán)儀,，可以在恒定溫度下進(jìn)行DNA擴(kuò)增。4.**熱穩(wěn)定性**：-BstDNAPolymerase,LargeFragment通常在65°C左右的溫度下進(jìn)行反應(yīng),，而BstDNAPolymeraseI可能具有更寬的反應(yīng)溫度范圍,。Recombinant Cynomolgus B7-1/CD80 Protein,His Tag