殘留的宿主DNA是生產(chǎn)中產(chǎn)生的雜質(zhì)，其存在潛在的致瘤性,、傳染性和免疫原性等風(fēng)險,。相關(guān)研究表明，基因的大小普遍在200bp以上,，因此大于200bp有可能會有一定的致病性,，而且殘留DNA片段越大，生物制品的風(fēng)險等級越高,。因此,，各國監(jiān)管機構(gòu)對其提出了嚴格要求。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）在《關(guān)于人類基因zhiliao新產(chǎn)品生產(chǎn)指導(dǎo)文件》中明確指出HCD的片段要小于200bp,。2022年5月,，國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心（CDE）發(fā)布的《體內(nèi)基因藥物產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中也明確指出需對DNA殘留量和殘留片段大小進行控制，建議盡量將DNA殘留片段的大小控制在200bp以下,。宿主細胞DNA主要以染色質(zhì)形態(tài)存在,，其中的組蛋白通過離子相互作用及疏水相互作用與DNA緊密結(jié)合；河北高鹽條件高鹽核酸酶70921-202

桿狀病毒表達載體體系Baculovirus/Sf9(Baculovirusexpression vector,，BEV),，是應(yīng)用桿狀病毒表達載體(BEV)系統(tǒng)infect昆蟲細胞Sf9，是一種替代哺乳動物包裝細胞系的生產(chǎn)方案,。整個系統(tǒng)包含兩種BEV,，其中一個BEV攜帶兩側(cè)有ITRs的目的基因，另一BEV則攜帶rep/cap基因,。這兩種BEV同時infectSf9即可組裝AAV,。由于桿狀病毒具有輔助功能,，因此BEV系統(tǒng)與可以穩(wěn)定表達rep的Sf9細胞相結(jié)合，可用于靈活的,、高滴度的大規(guī)模載體生產(chǎn),。BEV體系安全性好,infection效率高,生產(chǎn)工藝較之sTT更易放大，有更高的體積生產(chǎn)率優(yōu)勢,。江蘇基因藥物生產(chǎn)用高鹽核酸酶70921-150高鹽濃度能夠減少目標產(chǎn)物聚集,、增加目標產(chǎn)物溶解度及提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量。

AAV病毒滴度通常分為物理滴度和infection滴度,。物理滴度一般是指基因組滴度或者衣殼滴度,。在測定AAV的含量時，通常采用基因組滴度或者衣殼滴度作為單位,，其中基因組滴度為攜帶基因組的AAV的濃度,，衣殼滴度為AAV物理顆粒的濃度?；蚪M滴度一般采用qPCR,、ddPCR、染料法,、UV/Vis等方法來測定,；衣殼滴度主要是通過ELISA、HPLC等方法來測定,。AAV基因組滴度檢測的關(guān)鍵在于盡可能徹底去除AAV衣殼外的HCD殘留,，減少污染核酸對qPCR或ddPCR的影響。經(jīng)典方法是加入常規(guī)核酸酶（如Dnase I,、Benzonase等）消化AAV衣殼外的HCD殘留,，然后加入Proteinase K破碎病毒衣殼，進行后續(xù)檢測,。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn),，用SAN HQ高鹽核酸酶替代常規(guī)核酸酶處理AAV病毒,，能夠更高效去除衣殼外的核酸殘留,，qPCR或ddPCR結(jié)果重復(fù)性更高、更穩(wěn)定,。

ArcticZymes廠家對鹽活性核酸酶系列產(chǎn)品（Salt Active Nucleases,，SANs）的生產(chǎn)及質(zhì)控，包括SAN HQ高鹽核酸酶和M-SAN HQ中鹽核酸酶,，在符合ISO13485:2016體系基礎(chǔ)上,，增加了cGMP質(zhì)控標準，如microbes,、endotoxin,、蛋白酶等,；同時提供TSE/BSE聲明、無動物源（Animal-Origin Free）聲明,、非轉(zhuǎn)基因聲明等文件協(xié)助藥物申報,。此外，ArcticZymes的生產(chǎn)場地接受客戶的定期審計,，其第三方審計文件已得到國際TOP CDMO及Biotech的認可,，并已經(jīng)成為國際TOP CDMO的供應(yīng)商。具體文件體系可以跟廠家或?qū)?yīng)銷售人員聯(lián)系,。在如抗體,、病毒載體藥物等的生產(chǎn)工藝流程中，核酸雜質(zhì)的去除至關(guān)重要,。

綜合腺相關(guān)病毒AAV制備的三個工藝階段介紹,，可以看出下游處理可以占病毒生產(chǎn)總成本的很大一部分，而且難度也是非常大,，尤其是純化過程,。原因之一是由于有超過100種不同血清型的變體AAV衣殼，不同血清型的AAV蛋白存在差異,。因此,，各種血清型的表面特性增加AAV純化難度。原因之二是：針對工藝和產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)（包括宿主細胞物質(zhì),，DNA和空衣殼）,，缺乏一個有效和可重復(fù)的平臺方法，尤其是來從空衣殼中分離出完整的衣殼,。為了解決以上問題,，國內(nèi)外大的藥企公司都致力于純化新產(chǎn)品的開發(fā)，以期達到：（1）實現(xiàn)病毒顆粒的分離（2）減少產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)（3）保持效力和產(chǎn)量的目標,。GMP級別SAN HQ提供了更多的監(jiān)管保證,。山西ArcticZymes高鹽核酸酶70921-202

SAN HQ高鹽核酸酶有兩個級別，分別是生物工藝級別SAN HQ和GMP級別SAN HQ GMP,。河北高鹽條件高鹽核酸酶70921-202

離子交換層析 (IEC) 是一種簡單,、通用且經(jīng)濟高效的技術(shù)，已成為許多載體純化的關(guān)鍵步驟,。IEC分為陰離子/陽離子交換柱,，其中AEC（Anion-exchange chromatography）適用于AAV純化，是大規(guī)模AAV生產(chǎn)中去除空衣殼的主要手段,。AAV衣殼亞種之間因表面電荷的差異導(dǎo)致不同的的等電點,。空衣殼PI在6.3左右,，包裝了完整基因組DNA后的病毒顆粒PI大致為5.9,。AAV與基質(zhì)之間的靜電相互作用正是取決于衣殼的等電點(pI)和緩沖液的pH值,。基于這一原理在正電荷固定相上進行樣品的分離純化,，去除雜質(zhì)（如空衣殼和部分衣殼）,，并有效地回收目的載體。河北高鹽條件高鹽核酸酶70921-202

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