雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小,，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高,。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬,?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源,。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰,。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小,。雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測,。進口雙光子顯微鏡的原理

其實電子顯微鏡相比于光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢或者存在的比較大意義，準(zhǔn)確的來說,，不在于放大倍數(shù),，而在于超高的分辨率。這兩者是不同的,。通俗的來說,，就是進行觀察的時候，除了要將物體放大,，還需要能將它與相鄰的其他物體分辨開來,。如果兩個相鄰微粒的圖像在光學(xué)顯微鏡下，即使放大到很大,，看到的可能卻是兩個相交的亮斑（艾里斑）,，而沒有明顯的界限（更不用說細節(jié)了），這表示是分辨率不夠,。拋開分辨率談放大倍數(shù)是沒有意義的,。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限，約等于光波波長的一半,，通常被說成是光學(xué)顯微鏡放大極限,，其實準(zhǔn)確地來說，應(yīng)該叫做分辨率的極限,。而其產(chǎn)生的原因是光的衍射,，根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實驗證明了電子的波動性,，于是用電子代替光的電子顯微鏡成為可能,。電子顯微鏡也有多種，題主說的是像REM的,。電鏡也存在用衍射規(guī)則觀察的,，比如低能電子衍射（LEED）和透射電鏡（TEM）。兩者主要用于觀察晶體,，根據(jù)其周期性的特點而生成倒易空間里的衍射圖像,，借助elward球或者傅里葉變換就可以轉(zhuǎn)換到實空間,，得到真正的晶體表面圖像了。美國ultima2PPLUS雙光子顯微鏡的原理雙光子顯微鏡非常適合對細胞組織進行長時間在體成像,。

雙光子技術(shù)在醫(yī)療診斷應(yīng)用中具有巨大的潛力,，該領(lǐng)域還未形成標(biāo)準(zhǔn)和體系，需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究與龐大的醫(yī)療數(shù)據(jù)加以支撐,，通過研究人體基于多光子成像技術(shù),，進行細胞結(jié)構(gòu)、生化成分,、微環(huán)境,、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息,，找到與疾病的細胞學(xué),、分子生物學(xué)、組織病理學(xué),、診斷和特征的關(guān)聯(lián)關(guān)系,，共同探究生理病理基礎(chǔ)和分子細胞生物學(xué)機制，篩選鑒定,、皮膚病,、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據(jù)，建立全新的多光子細胞診斷的完整數(shù)據(jù)庫,，定義出針對不同疾病的多光子臨床檢測設(shè)備的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn),。討論環(huán)節(jié)，來自病理科,、呼吸中心,、心臟科、神經(jīng)科,、皮膚科及研究所的多位醫(yī)師及研究人員紛紛結(jié)合各自的工作領(lǐng)域與王愛民副教授展開了熱烈的討論,，其中毛發(fā)中心楊頂權(quán)主任計劃再次邀請王愛民副教授進行學(xué)術(shù)交流。通過本次學(xué)術(shù)交流,，病理科與研究所分別與王愛民副教授課題組達成了初步合作意向,。

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短激發(fā)態(tài)后，發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。因其光損傷小,、樣本透射深等優(yōu)勢，使得觀察熒光細胞成為可能,。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所-雙光子顯微鏡成像平臺借助于雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的***成像研究,。以小鼠顱內(nèi)***成像為優(yōu)勢,，可動態(tài)**觀察小鼠顱內(nèi)神經(jīng)細胞、小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞,、周細胞,、血管、轉(zhuǎn)移瘤細胞,、膠質(zhì)瘤細胞等的變化情況,，在**學(xué)、神經(jīng)生物學(xué),、發(fā)育生物學(xué),、神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。小鼠其它組織臟器,，如脾,、肺,、顱骨,、股骨、胸骨等也可借助本平臺進行成像研究,。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進行有生命體成像,。

王愛民副教授結(jié)合工作實例，展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應(yīng)用,。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn),，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，重量只為2.2克,，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰,、穩(wěn)定的圖像，該顯微鏡適于佩戴在小動物頭部,，可實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元,、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號，在大型動物上,，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴,、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景,，首先雙光子顯微鏡能夠進行細胞和組織結(jié)構(gòu)成像,，在亞微米級成像，此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似,；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r,、在體、原位,、無創(chuàng)地,，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性,，區(qū)分成像；雙光子顯微鏡能夠進行生化指標(biāo)成像,，在無造影劑的前提下,，利用自發(fā)熒光、二次諧波,、熒光獲得活細胞生化信息,。雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的成像研究。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

雙光子顯微鏡不需要共聚焦,，提高了熒光檢測效率,。進口雙光子顯微鏡的原理

系統(tǒng)示意圖如圖1所示，紅外激光束從藍寶石激光器出射后,，由一個光學(xué)參量振蕩器（OPO）轉(zhuǎn)化到可見光波段,，產(chǎn)生的可見光脈沖寬度為200 fs, 重復(fù)頻率80 MHz，波長在490-750nm范圍內(nèi)可調(diào)諧,。光束通過透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中,，形成用于熒光激發(fā)的多焦點光束。多焦點光束通過一個硅油浸潤的物鏡成像到樣品上,，激發(fā)熒光信號,。熒光信號由同一個物鏡收集并傳輸?shù)疥嚵袌A盤，產(chǎn)生共焦效應(yīng),，隔離來自焦平面外的雜散光,。進口雙光子顯微鏡的原理