Winfried Denk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100 fs脈寬,、630 nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,，鈦寶石飛秒可調諧激光器位于平臺較左邊?？茖W家正在從雙光子轉向三光子顯微鏡,。1996年，Chris Xu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長,，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米,，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達到這些要求,，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢,。美國熒光雙光子顯微鏡光毒性

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強,？因為組織對可見光區(qū)域的較強吸收和散射帶來兩個嚴重的問題第1個是激發(fā)光的減弱，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學特性,，單光子激發(fā)的背景較強,，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率因為組織對可見光區(qū)域的較強吸收和散射帶來兩個嚴重的問題第1個是激發(fā)光的減弱，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學特性,，單光子激發(fā)的背景較強,，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率剛好雙光子在這兩點具有很大的優(yōu)勢上面的內容基本在談到雙光子優(yōu)勢都會相對說明，在實際操作中成像的深度和樣品的關系很大,，雙光子成像利用高亮度的熒光標記材料,，已經(jīng)有做到mm級別的穿透深度進口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為光源；

光學顯微鏡和電子顯微鏡本質的區(qū)別在于,，光學顯微鏡：用的是可見光電子顯微鏡：用的是高頻電子射波有什么區(qū)別,，在于一個基本的原理，光的衍射,。,。。光波是一個有趣的東西,，其中有一項,，如果物體的體積小于光的波長，光一般可以繞過去,，不發(fā)生明顯變化,。也就是說，有這個物體和沒這個物體,，在這種情況下,，光是不會發(fā)生明顯改變的?？梢姽獾牟ㄩL（肉眼）：380～780納米,，也就是，如果比380納米還要小的東西,，用光學顯微鏡,，無論你放大多少倍，也是看不見的,。因為光繞過去了,。,。。光的衍射為了克服這個問題,，科學家用波長更短的光去照射物體,，也是就被觀測物。比如10納米級的光,，這樣,，就能看到我們用肉眼無論如何都看不見的東西。這就是電子顯微鏡多說一句,，光速是不變的。光速=頻率×波長,。波長越短,，頻率越大。,。頻率越大,，光波的能量越大。這就是為什么電子顯微鏡的功率越大,，能看到的東西越小,。顏色取決于物體能反射光的波長的長短當你看到的物體小于較小可見光的波長，那它就是沒有顏色的,。,。。因為顏色是肉眼對于可見光頻率在大腦中的投影,。,。。,。所以只能把他們統(tǒng)一變?yōu)楹诎?。。,。沒有顏色不是透明的意思,，它們不是肉眼可見顏色的定義中包含的。

而配合了雙光子激發(fā)技術,，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效,。那么，什么是雙光子激發(fā)技術呢,？在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后,，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）,。利用這個原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的,，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡,，被光探頭接收,，從而達到逐點掃描的效果。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應用,。

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對***細胞和組織的光損傷小,，適用于長時間的研究,；☆穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對生物組織中深層物質的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收只局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點處,，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學濾波器（共焦***）,，這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高,；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長,，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16，較大降低了散射的干擾,；☆光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性,，所以可以對生物組織中一些特殊物質進行成像研究；雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當中,；進口investigator雙光子顯微鏡商家電話

雙光子顯微鏡的原理是什么,？美國熒光雙光子顯微鏡光毒性

雙光子顯微成像技術不是什么新技術，早在20多年前就有了,，目前已經(jīng)在生命科學和材料科學中廣泛應用,。幾年前雙光子過期后,，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上。即便如此,，世界上很多實驗室都搭雙光子,，自己搭的好處有很多，首先是便宜,，尤其是實驗室已經(jīng)有飛秒激光器,，那就更很省錢了。其次是靈活,，可以選擇針對特殊用途的搭配,，改動也靈活。好處就是可以鍛煉隊伍,，一趟走下來可以把新手帶出來,，后期維護也更加自由。當然壞處也不少,，首先是操心，特別是第1次搭的時候,，開始要想方案,，后來要解決各種實際問題。其次是花時間,，加上買配件的時間,，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長。現(xiàn)在已經(jīng)有不少關于如何搭雙光子顯微鏡的文章,，各種protocol,，大多是老外寫的，中文的較少,。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的,，尤其是沒有經(jīng)驗的時候，容易走彎路,，多花錢,，也多花時間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買,，在國內買這些東西耗時較長,。因此，我想總結一下我們的經(jīng)驗,，貼出來分享,，希望能幫到想自己動手的實驗室，美國熒光雙光子顯微鏡光毒性