Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導(dǎo)樹突鈣離子動態(tài)后,，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯,。值得一提的是，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強大的多光子介觀顯微鏡,，其成像視場達(dá)到5毫米,，能夠跨多個腦區(qū)進(jìn)行高速功能成像。根據(jù)清華大學(xué)單一采購來源的**指導(dǎo)意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍,。30年來,，雙光子顯微鏡已成為較厚生物組織三維成像中不可或缺的工具。從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡,。自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量，發(fā)展速度可見一斑,。雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡,。美國激光雙光子顯微鏡成像原理

2020年，臨研所,、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報告,。學(xué)術(shù)報告由臨研所醫(yī)學(xué)實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民,，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，獲學(xué)士,、碩士學(xué)位,，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”,。目前,，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來即時病理、離體組織檢測,、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法,。激光熒光雙光子顯微鏡分辨率是多少雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢,？

利用鈣成像技術(shù)記錄大腦活動,，隨著功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展，神經(jīng)學(xué)家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)部的工作情況,。功能鈣成像技術(shù)就是其中之一,，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現(xiàn)象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，以此細(xì)胞的功能狀態(tài),。目前它被廣泛應(yīng)用于實時監(jiān)測一群相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化,，從而判斷其功能活動。該技術(shù)的出現(xiàn)使得科學(xué)家可以親眼目睹神經(jīng)信號在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中時間和空間上的傳遞穿梭,。

像差問題一直困擾著光學(xué)領(lǐng)域的工作者,。像差會使光波前發(fā)生形變，不僅降低成像的信噪比和分辨率,，使得很多時候我們只能“霧里看花”,，更甚者，產(chǎn)生贗像,，或無法獲得有意義的圖像,。像差問題對雙光子成像的影響尤為嚴(yán)重，因為在那里,，熒光信號對入射光強度的依賴是平方關(guān)系,，一旦入射光波前形變，不僅聚焦強度大幅下降,，成像分辨率也急劇惡化,。因此，如何解決像差問題,，實現(xiàn),，例如小鼠大腦皮層，深層區(qū)域的高質(zhì)量成像成為光學(xué)成像發(fā)展中相當(dāng)有挑戰(zhàn)性的問題之一,。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用,。

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強度,，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小,。雙光子顯微鏡能夠在細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞水平上對神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),、離子濃度、細(xì)胞運動,、進(jìn)行直接成像監(jiān)測,。美國激光雙光子顯微鏡廠家有哪些

雙光子顯微鏡可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝。美國激光雙光子顯微鏡成像原理

N摻雜可以明顯影響碳點（CDs）的發(fā)射和激發(fā)特性,，使雙光子碳點（TP-CDs）具有本征雙光子激發(fā)特性和605 nm的紅光發(fā)射特性,。在638 nm激光照射下，除了長波激發(fā)和發(fā)射外,，還可以實現(xiàn)活性氧（ROS）的產(chǎn)生,，這為光動力技術(shù)提供了巨大的可能性。更重要的是,，通過各種表征和理論模擬證實,，摻雜誘導(dǎo)的N雜環(huán)在TP-CDs與RNA的親和力中起關(guān)鍵作用。這種親和力不僅為實現(xiàn)核仁特異性自我靶向提供了可能,，而且通過ROS斷裂RNA鏈解離TP-CDs@RNA復(fù)合物,，賦予治療過程中的熒光變異,。TP-CDs結(jié)合了ROS的產(chǎn)生能力、光動力療法（PDT）過程中的熒光變化,、長波激發(fā)和發(fā)射特性以及核仁的特異性自靶向性,，可以認(rèn)為是一種結(jié)合核仁動態(tài)變化實時處理的智能CDs。美國激光雙光子顯微鏡成像原理

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