雙光子顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)波長較長的光子,，經(jīng)過短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后，發(fā)射一個(gè)波長較短的光子,；效果和用波長為長波長一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的,。雙(多)光子成像的優(yōu)點(diǎn)是具有更深的組織穿透深度，紅外光可以在平面上探測到極限為1mm的組織區(qū)域,；因?yàn)樾盘?hào)背景比高,，所以具有更高的對(duì)比度；由于激發(fā)體積小,，具有定點(diǎn)激發(fā)、光毒性小的特點(diǎn),；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，更加安全,。雙光子顯微鏡的原理是什么,？國外熒光雙光子顯微鏡成像原理

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號(hào)分子其作用具有時(shí)間性和空間性。當(dāng)個(gè)細(xì)胞興奮時(shí),，產(chǎn)生了一個(gè)電沖動(dòng),，此時(shí)，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi),，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì),，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動(dòng),。以此類推,，神經(jīng)信號(hào)便一級(jí)一級(jí)地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)體系,，終形成學(xué)習(xí),、記憶等大腦的高級(jí)功能。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號(hào)分子的角色,。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM,，而細(xì)胞興奮時(shí)鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對(duì)于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少,。眾所周知,，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定,，同時(shí)也受鈣結(jié)合蛋白的影響,。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道,、離子型谷氨酰胺受體,、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時(shí)受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來,，以反映神經(jīng)元活性,。該方法可以同時(shí)去觀察多個(gè)功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞。國外bruker雙光子顯微鏡磷光壽命計(jì)數(shù)雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測,。

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子使電子躍遷到較高能級(jí),，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后,，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù),。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光,，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，從而被光探頭接收,，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果,。

使用雙光子顯微鏡可以以亞細(xì)胞分辨率對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動(dòng),；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng),，但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來說太快,。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實(shí)現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對(duì)膜電壓變化進(jìn)行成像,，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示,。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，其脈沖時(shí)間間隔為2ns,。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點(diǎn)越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。雙光子顯微鏡除了可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝以外呢，可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行成像,。

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深,，對(duì)生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)較左邊,?？茖W(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長的波長,，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米,，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。在深度組織中以較長時(shí)間對(duì)細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。國外雙光子顯微鏡熒光探測

雙光子顯微鏡有哪些分類呢,？國外熒光雙光子顯微鏡成像原理

隨著技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn),，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升,。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手,，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造,。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì),，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個(gè)問題，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理,。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解,，讓標(biāo)本的“透明度”得到提高,。國外熒光雙光子顯微鏡成像原理