與傳統(tǒng)的單光子寬場熒光顯微鏡相比,，多光子顯微鏡(MPM)具有光學切片和深度成像的功能,，極大地促進了研究人員對整個大腦深部神經(jīng)的認識。2019年,，JeromeLecoq等從腦深部神經(jīng)元成像,、大數(shù)量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像三個方面討論了相關(guān)的MPM技術(shù),。為了將神經(jīng)元活動與復雜行為聯(lián)系起來,，通常需要對大腦皮層深處的神經(jīng)元進行成像，這就要求MPM具備深度成像的能力,。激發(fā)光和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收,，這是限制MPM成像深度的主要因素。雖然增加激光強度可以解決散射問題,，但會帶來其他問題,，如燒焦樣品、散焦和近表面熒光激發(fā),。增加MPM成像深度的比較好方法是使用更長的波長作為激發(fā)光,。另外，對于雙光子（2P）成像而言,，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素,，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號,。 全球多光子顯微鏡主要廠商基本情況介紹，包括公司簡介,、多光子顯微鏡產(chǎn)品型號,、產(chǎn)量、產(chǎn)值及動態(tài)等,。布魯克多光子顯微鏡成像精度

比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出，基于分子光學標記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢,。例如,，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實現(xiàn)對分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm，時間分辨率;分鐘量級,。與PET比較,，光學成像的應用場合更廣（可測量更多的參數(shù)，請參見表1-1）,，且具有更高的時間分辨率（秒級）,，空間分辨率可達到微米。因此,，二者相比,，雖然光學成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數(shù)種類與時空分辨率方面有一定優(yōu)勢,。對于小動物（如小白鼠）研究來說,，光學成像技術(shù)可以實現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達成像。例如,，初步研究表明,，熒光介導層析成像可達到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達的實時在體成像。進口多光子顯微鏡成像分辨率多光子顯微鏡的發(fā)展現(xiàn)狀及未來發(fā)展趨勢,。

多束掃描技術(shù)可以同時對神經(jīng)元組織的不同位置進行成像該技術(shù)：對兩個遠距離（相距大于1-2 mm）的成像部位,，通常使用兩條單獨的路徑進行成像；對于相鄰區(qū)域,，通常使用單個物鏡的多光束進行成像,。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串擾問題，這個問題可以通過事后光源分離方法或時空復用方法來解決,。事后光源分離方法指的是用算法來分離光束消除串擾,；時空復用方法指的是同時使用多個激發(fā)光束，每個光束的脈沖在時間上延遲,，這樣就可以暫時分離被不同光束激發(fā)的單個熒光信號,。引入越多路光束就可以對越多的神經(jīng)元進行成像，但是多路光束會導致熒光衰減時間的重疊增加,，從而限制了區(qū)分信號源的能力,；并且多路復用對電子設(shè)備的工作速率有很高的要求；大量的光束也需要更高的激光功率來維持近似單光束的信噪比,，這會容易導致組織損傷,。

快速光柵掃描有多種實現(xiàn)方式，使用振鏡進行快速2D掃描,，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進行快速3D掃描,，但可調(diào)電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換，影響成像速度,，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替,。遠程聚焦也是一種實現(xiàn)3D成像的手段,，如圖2所示。在LSU模塊中,，掃描振鏡進行橫向掃描,，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調(diào)控M的位置實現(xiàn)軸向掃描,。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差,，還可以進行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像,，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計來擴大FOV,，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無法快速移動以進行快速軸向掃描,，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠程聚焦,、SLM和可調(diào)電動透鏡。多光子顯微鏡適用于動物大腦皮層深層（400微米）細胞的形態(tài),、生理學研究,。

   多光子顯微鏡的前景巨大 作為一個多學科交叉、知識密集,、資金密集的高技術(shù)產(chǎn)業(yè),，多光子顯微鏡涉及醫(yī)學、生物學,、化學,、物理學、電子學,、工程學等學科,，生產(chǎn)工藝相對復雜，進入門檻較高,，是衡量一個國家制造業(yè)和高科技發(fā)展水平的重要標準之一,。過去的5年，多光子顯微鏡市場集中,，由于投產(chǎn)生產(chǎn)的成本較高,，技術(shù)難度大，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多,。顯微鏡作為一個傳統(tǒng)的高科技行業(yè),，其作用至今沒有被其他技術(shù)顛覆，只是不斷融合并發(fā)展相關(guān)技術(shù),，在醫(yī)療和其他精密檢測領(lǐng)域發(fā)揮著更大的作用,。顯微鏡的商業(yè)化發(fā)展已進入成熟期，主要需求來自教學,、生命科學的研究及精密檢測等,，全球市場呈現(xiàn)平緩的增長態(tài)勢,。然而，**,、、顯微鏡產(chǎn)品（如多光子顯微鏡,、電子顯微鏡）正拉動市場需求,，多光子顯微鏡市場發(fā)展?jié)摿薮蟆?多光子顯微鏡的成熟的深部組織成像技術(shù)中。還有其他類型的圖像對比提供有關(guān)樣本的有價值信息,。嚙齒類多光子顯微鏡焦點激發(fā)

從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。布魯克多光子顯微鏡成像精度

2020年,，TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2],。在光學顯微鏡中，物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度,。近年來,，通過使用遠程聚焦技術(shù)或電可調(diào)諧透鏡（ETL）已經(jīng)實現(xiàn)了快速軸向掃描；但是,，遠程聚焦中反射鏡的機械驅(qū)動會限制軸向掃描速度,，ETL會引入球面像差和更高階像差，從而無法進行高分辨率成像,。為了克服這些局限性,，該組引入了一種新穎的光學設(shè)計，能將橫向掃描轉(zhuǎn)換為可用于高分辨率成像的無球差的軸向掃描,。該設(shè)計有兩種實現(xiàn)方式,，第一種能夠執(zhí)行離散的軸向掃描，另一種能夠進行連續(xù)的軸向掃描,。具體裝置如圖3a所示,，由兩個垂直臂組成，每個臂中都有一個4F望遠鏡和一個物鏡,。遠程聚焦臂包含一個檢流掃描鏡（GSM）和一個空氣物鏡（OBJ1）,，另一個臂（稱為照明臂）由一個水浸物鏡（OBJ2）構(gòu)成。將這兩個臂對齊,，以使GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛,。準直的激光束被偏振分束器反射到遠程聚焦臂中，GSM對其進行掃描,，進而使得OBJ1產(chǎn)生的激光焦點進行橫向掃描,。布魯克多光子顯微鏡成像精度