激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源,，激光束經(jīng)照明,，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上,，對標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描,。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測時先聚焦,，然后被光探頭收集,，轉(zhuǎn)化為信號輸送到計算機(jī)進(jìn)行處理。這個裝置能讓通過探測的只有焦平面上發(fā)出的熒光,，使成像更為清晰準(zhǔn)確,，同時通過改變物鏡的焦距，能對不同焦平面進(jìn)行掃描,，通過計算機(jī)繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像,。而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效,。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,，經(jīng)過一個很短的時間后,，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù),。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細(xì)孔，提高了熒光檢測效率,。熒光激光雙光子顯微鏡授權(quán)公司

在該自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡中,，她們將空間光位相調(diào)制器光學(xué)共軛到顯微物鏡的后焦平面，通過位相調(diào)制器將入射光分成若干子區(qū)域,，每一塊子區(qū)域的波前都可以被控制,。同時,，她們用數(shù)字微陣列光處理器,，以不同的頻率同時調(diào)制其中一半子區(qū)域的入射光強(qiáng)度，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”,。來自所有子區(qū)域光束會在焦點(diǎn)處會聚干涉,，通過監(jiān)測焦點(diǎn)激發(fā)的雙光子信號隨時間的變化情況，并進(jìn)行傅里葉變換分析,，可以“分解”得到被調(diào)制的每一塊子區(qū)域的“光線”的貢獻(xiàn)信息,，從而可以實現(xiàn)對一半子區(qū)域波前的并行測量。對另一半子區(qū)域重復(fù)這一測量過程,，從而獲得整個入射波前的信息并進(jìn)行校正,。該方法耗時很短，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正,，無需復(fù)雜的計算,，適用于任何標(biāo)記密度和標(biāo)記類型的樣品。更重要的是,，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內(nèi)的成像質(zhì)量,。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物、醫(yī)學(xué)問題提供了可行性方案,。美國2PPLUS雙光子顯微鏡分辨率對于顯微成像技術(shù)包含：寬場熒光顯微鏡,、激光共聚焦顯微鏡、轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡,、雙光子顯微鏡,。

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有 100 飛秒,，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時,，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦,，提高了熒光檢測效率,。

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強(qiáng)度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小,，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高,。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬,?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源,。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰,。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子技術(shù)和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡,。

微型化雙光子熒光顯微成像改變了在自由活動動物中觀察細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方式,，可用于在動物覓食、哺乳,、跳臺,、打斗、嬉戲,、睡眠等自然行為條件下,，或者在學(xué)習(xí)前、學(xué)習(xí)中和學(xué)習(xí)后,，長時程觀察神經(jīng)突觸,、神經(jīng)元、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),、遠(yuǎn)程連接的腦區(qū)等多尺度,、多層次動態(tài)變化。該成果在2016年底美國神經(jīng)科學(xué)年會,、2017年5月冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會議上報告后,，得到包括多位諾貝爾獎獲得者在內(nèi)的國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)家的高度贊譽(yù),。冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會議,、美國明顯神經(jīng)科學(xué)家加州大學(xué)洛杉磯分校的Alcino J Silva教授在評述中寫道，“從任何一個標(biāo)準(zhǔn)來看,，這款顯微鏡都了一項重大技術(shù)發(fā)明,，必將改變我們在自由活動動物中觀察細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方式。它所開啟的大門,，甚至超越了神經(jīng)元和樹突成像,。系統(tǒng)神經(jīng)生物學(xué)正在進(jìn)入一個新的時代，即通過對細(xì)胞群體中可辨識的細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜生物學(xué)事件進(jìn)行成像觀測,，從而更加深刻地理解進(jìn)化所造就的大腦環(huán)路實現(xiàn)復(fù)雜行為的重要工程學(xué)原理,。毫無疑問，這項非凡的發(fā)明讓我們向著這一目標(biāo)邁進(jìn)了一步,?！彪p光子顯微鏡已延伸到各個領(lǐng)域研究中，它能對樣品進(jìn)行三維觀察,。國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡成像視野

雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器,。熒光激光雙光子顯微鏡授權(quán)公司

2020年，臨研所,、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報告,。學(xué)術(shù)報告由臨研所醫(yī)學(xué)實驗研究平臺潘琳老師主持,。王愛民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士、碩士學(xué)位,，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”,，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前,，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來即時病理、離體組織檢測,、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法,。熒光激光雙光子顯微鏡授權(quán)公司

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