雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。下面是兩種技術(shù)的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米,，甚至超過1毫米,。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。國外熒光雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)

2008年錢永健等人由于熒光蛋白（GFP,，綠色熒光蛋白）的發(fā)現(xiàn)和使用，獲得了諾貝爾化學(xué)獎,，是對熒光成像技術(shù)的一次巨大肯定和推動,。光學(xué)成像本身具有高分辨率、高通量,、非侵入和非毒性等特點,，再與熒光蛋白以及熒光染料等標(biāo)記物在細(xì)胞中的定位與表達(dá)技術(shù)相結(jié)合，使得科學(xué)家可以特異性的分辨生物體乃至細(xì)胞內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)與成分,，并且能夠在生命體和細(xì)胞仍具有活性的狀態(tài)下（狀態(tài)）對其功能進(jìn)行動態(tài)觀察,。這就使得熒光成像技術(shù)成為了無可替代的，生物學(xué)家現(xiàn)今較為重要的技術(shù)手段之一,。目前,，大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)和生理學(xué)研究主要還是在離體培養(yǎng)的細(xì)胞體系中研究。然而與細(xì)胞生物學(xué)研究有所不同的是,，大腦的功能研究的整體性和原位性顯得更加關(guān)鍵：只研究分離的神經(jīng)元無法解釋神經(jīng)系統(tǒng)的功能和規(guī)律,。由于被觀測的信號會受到樣本組織的散射和吸收，根本無法穿透如此深的組織進(jìn)行成像,。而雙光子顯微鏡（Two-photonMicroscopy,，簡稱TPM）的發(fā)明，則為此類研究帶來了希望,。雙光子顯微鏡特有的非線性光學(xué)特性,，再加上其工作波長處在紅外區(qū)域等特點，令其在生物體組織內(nèi)的穿透深度較大提高,，使得雙光子顯微鏡成為神經(jīng)科學(xué)家進(jìn)行神經(jīng)成像較理想的工具,。進(jìn)口布魯克雙光子顯微鏡成像視野一般是多少雙光子顯微鏡的應(yīng)用中，該如何選擇以及更好的使用PMT,。

其實電子顯微鏡相比于光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢或者存在的比較大意義,，準(zhǔn)確的來說，不在于放大倍數(shù),，而在于超高的分辨率,。這兩者是不同的。通俗的來說,，就是進(jìn)行觀察的時候,，除了要將物體放大，還需要能將它與相鄰的其他物體分辨開來,。如果兩個相鄰微粒的圖像在光學(xué)顯微鏡下,，即使放大到很大，看到的可能卻是兩個相交的亮斑（艾里斑）,，而沒有明顯的界限（更不用說細(xì)節(jié)了）,，這表示是分辨率不夠。拋開分辨率談放大倍數(shù)是沒有意義的,。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限,，約等于光波波長的一半，通常被說成是光學(xué)顯微鏡放大極限,，其實準(zhǔn)確地來說,，應(yīng)該叫做分辨率的極限。而其產(chǎn)生的原因是光的衍射,，根本原因是光的波粒二象性,。電子衍射實驗證明了電子的波動性，于是用電子代替光的電子顯微鏡成為可能,。電子顯微鏡也有多種,，題主說的是像REM的。電鏡也存在用衍射規(guī)則觀察的,，比如低能電子衍射（LEED）和透射電鏡（TEM）。兩者主要用于觀察晶體,，根據(jù)其周期性的特點而生成倒易空間里的衍射圖像,，借助elward球或者傅里葉變換就可以轉(zhuǎn)換到實空間,，得到真正的晶體表面圖像了。

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像,，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢,？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點,，何況一臺儀器呢,，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品，對于厚的或者樣品不能進(jìn)拍攝,；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點進(jìn)行掃描,，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時就更容易對樣品進(jìn)行淬滅,；3. 由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面,，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進(jìn)行激發(fā),，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗,，效率非常低。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒,，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲,。雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子技術(shù)和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡。

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像,，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導(dǎo)樹突鈣離子動態(tài)后,，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯。值得一提的是,，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強(qiáng)大的多光子介觀顯微鏡,，其成像視場達(dá)到5毫米，能夠跨多個腦區(qū)進(jìn)行高速功能成像,。根據(jù)清華大學(xué)單一采購來源的**指導(dǎo)意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍,。30年來，雙光子顯微鏡已成為較厚生物組織三維成像中不可或缺的工具,。從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡,。下圖統(tǒng)計了自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量，發(fā)展速度可見一斑,。雙光子顯微鏡非常適合對細(xì)胞組織進(jìn)行長時間在體成像,。進(jìn)口布魯克雙光子顯微鏡成像視野一般是多少

雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用。國外熒光雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)

在2020年12月22日,，臨研所,、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報告。學(xué)術(shù)報告由臨研所醫(yī)學(xué)實驗研究平臺潘琳老師主持,。王愛民,，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士,、碩士學(xué)位，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”,，并被Nature Methods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”,。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來即時病理,、離體組織檢測、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法,。國外熒光雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)

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