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對電極持續(xù)施加一個1mV,、10~50ms的階躍脈沖刺激,,電極入水后電阻約4~6MΩ,此時在計算機屏幕顯示框中可看到測試脈沖產(chǎn)生的電流波形,。開始時增益不宜設(shè)得太高,,一般可在1~5mV/pA,以免放大器飽和,。由于細(xì)胞外液與電極內(nèi)液之間離子成分的差異造成了液結(jié)電位,,故一般電極剛?cè)胨畷r測試波形基線并不在零線上,須首先將保持電壓設(shè)置為0mV,,并調(diào)節(jié)“電極失調(diào)控制“使電極直流電流接近于零,。用微操縱器使電極靠近細(xì)胞,當(dāng)電極前列與細(xì)胞膜接觸時封接電阻指示Rm會有所上升,,將電極稍向下壓,,Rm指示會進一步上升。通過細(xì)塑料管向電極內(nèi)稍加負(fù)壓,,細(xì)胞膜特性良好時,,Rm一般會在1min內(nèi)快速上升,直至形成GΩ級的高阻抗封接,。一般當(dāng)Rm達(dá)到100MΩ左右時,,電極前列施加輕微負(fù)電壓(-30~-10mV)有助于GΩ封接的形成。此時的現(xiàn)象是電流波形再次變得平坦,,使電極超極化由-40到-90mV,,有助于加速形成封接。為證實GΩ封接的形成,,可以增加放大器的增益,,從而可以觀察到除脈沖電壓的首尾兩端出現(xiàn)電容性脈沖前列電流之外,電流波形仍呈平坦?fàn)?。離子和離子通道是細(xì)胞興奮的基礎(chǔ),,亦即產(chǎn)生生物電信號的基礎(chǔ),生物電信號通常用電學(xué)或電子學(xué)方法進行測量,。美國腦片膜片鉗腦片
離子通道的近代觀念源于Hodgkin,、Huxley、Katz等人在20世紀(jì)30—50年代的開創(chuàng)性研究,。在1902年,,Bernstein創(chuàng)造性地將Nernst的理論應(yīng)用到生物膜上,提出了“膜學(xué)說”,。他認(rèn)為在靜息狀態(tài)下,,細(xì)胞膜只對鉀離子具有通透性;而當(dāng)細(xì)胞興奮的瞬間,膜的破裂使其喪失了選擇通透性,,所有的離子都可以自由通過,。Cole等人在1939年進行的高頻交變電流測量實驗表明,當(dāng)動作電位被觸發(fā)時,,雖然細(xì)胞的膜電導(dǎo)大為增加,但膜電容卻只略有下降,,這個事實表明膜學(xué)說所宣稱的膜破裂的觀點是不可靠的,。1949年Cole在玻璃微電極技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)明了電壓鉗位(voltage clamp technique)技術(shù)進口膜片鉗產(chǎn)品介紹屯流鉗素向細(xì)胞內(nèi)注入刺激電流,記錄膜電位對刺激電流的反應(yīng),。
高阻封接問題的解決不僅改善了電流記錄性能,,還隨之出現(xiàn)了研究通道電流的多種膜片鉗方式。根據(jù)不同的研究目的,,可制成不同的膜片構(gòu)型,。細(xì)胞吸附膜片(cell-attachedpatch)將兩次拉制后經(jīng)加熱拋光的微管電極置于清潔的細(xì)胞膜表面上,形成高阻封接,,在細(xì)胞膜表面隔離出一小片膜,,既而通過微管電極對膜片進行電壓鉗制,分辨測量膜電流,,稱為細(xì)胞貼附膜片,。由于不破壞細(xì)胞的完整性,這種方式又稱為細(xì)胞膜上的膜片記錄,。此時跨膜電位由玻管固定電位和細(xì)胞電位決定,。因此,為測定膜片兩側(cè)的電位,,需測定細(xì)胞膜電位并從該電位減去玻管電位,。從膜片的通道活動看,這種形式的膜片是極穩(wěn)定的,,因細(xì)胞骨架及有關(guān)代謝過程是完整的,,所受的干擾小。
在心血管藥理研究中的應(yīng)用,,隨著膜片鉗技術(shù)在心血管方面的廣泛應(yīng)用,,對血管疾病和藥物作用的認(rèn)識不僅得到了不斷更新,而且在其病因?qū)W與藥理學(xué)方面還形成了許多新的觀點,。正如諾貝爾基金會在頒獎時所說:“Neher和Sadmann的貢獻(xiàn)有利于了解不同疾病機理,,為研制新的更為的藥物開辟了道路”。創(chuàng)新藥物研究與高通量篩選,,目前在離子通道高通量篩選中主要是進行樣品量大,、篩選速度占優(yōu)勢、信息量要求不太高的初級篩選。近幾年,,分別形成了以膜片鉗和熒光探針為基礎(chǔ)的兩大主流技術(shù)市場,。將電生理研究信息量大、靈敏度高等特點與自動化,、微量化技術(shù)相結(jié)合,,產(chǎn)生了自動化膜片鉗等一些新技術(shù)。在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極鉗制膜電位的同時,,記錄到ACh啟動的單通道離子電流,,從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù)。
ePatch雖然設(shè)備非常小巧,,但功能完備,,傳統(tǒng)膜片鉗設(shè)備能做的實驗,用ePatch幾乎都能做,。具有voltage-clamp,,current-clamp,zero current-clamp三種模式,,自動電極電壓飄移補償,,C-fast-C-slow-R-series-P/N補償,Bridge balance補償?shù)裙δ???梢宰鋈?xì)胞記錄也可以做單通道記錄,膜片鉗技術(shù)常做的離子通道電流,,突觸后電流,,動作電位檢測等實驗都能輕松實現(xiàn)。公司還為此開發(fā)了友好的控制和記錄軟件,,筆者上手接觸了一下,,發(fā)現(xiàn)跟AXON的軟件類似,并且程序編輯更為簡單易用,。所記錄到的數(shù)據(jù)可以直接使用Clampfit進行分析,,可以說對于使用過AXON設(shè)備的膜片鉗工作者來說,上手毫無難度,。典型的單通道電流呈一種振幅相同而持續(xù)時間不等的脈沖樣變化,。德國可升級膜片鉗市場價
對離子通道功能的研究,主要采用記錄離子通道電流來間接反映離子通道功能,。美國腦片膜片鉗腦片
膜片鉗技術(shù)本質(zhì)上也屬于電壓鉗范疇,,兩者的區(qū)別關(guān)鍵在于:①膜電位固定的方法不同;②電位固定的細(xì)胞膜面積不同,,進而所研究的離子通道數(shù)目不同,。電壓鉗技術(shù)主要是通過保持細(xì)胞跨膜電位不變,,并迅速控制其數(shù)值,以觀察在不同膜電位條件下膜電流情況,。因此只能用來研究整個細(xì)胞膜或一大塊細(xì)胞膜上所有離子通道活動,。目前電壓鉗主要用于巨大細(xì)胞的全性能電流的研究,特別在分子克隆的卵母細(xì)胞表達(dá)電流的鑒定中發(fā)揮著其他技術(shù)不能替代的作用,。該技術(shù)的主要缺陷是必須在細(xì)胞內(nèi)插入兩個電極,,對細(xì)胞損傷很大,在小細(xì)胞如元,,就難以實現(xiàn),,又因細(xì)胞形態(tài)復(fù)雜,很難保持細(xì)胞膜各處生物特性的一致,。美國腦片膜片鉗腦片
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