一,、記錄設(shè)備首先,，盡可能完善膜片鉗記錄設(shè)備是實(shí)驗(yàn)前的重要步驟,，如用模型細(xì)胞測(cè)定電子設(shè)備,、安裝并測(cè)試應(yīng)用軟件,、調(diào)節(jié)光學(xué)顯微鏡,、檢驗(yàn)防震工作臺(tái)等,。二,、微電極的制備膜片鉗電極是用外徑為1-2mm的毛細(xì)玻璃管拉制成的,。標(biāo)準(zhǔn)的毛細(xì)玻璃管（外經(jīng)1.5mm,，管壁厚0.3mm）適合于制作單通道記錄的微電極，而全細(xì)胞記錄則應(yīng)選管壁較?。?.16mm）的毛細(xì)玻璃管,，這樣可以使電極阻抗較低。三,、封接（Sealing）技術(shù)封接（seal）是膜片鉗記錄的關(guān)鍵步驟之一,。封接不好噪聲太大必然影響細(xì)胞膜電信號(hào)的記錄，一般要求封接阻抗至少20GΩ才可進(jìn)行常規(guī)記錄,。為了形成良好封接必須保持清潔的溶液,、良好的視野以及適當(dāng)?shù)碾姌O鍍膜。為了獲得較好的"千兆歐封接",，細(xì)胞表面必須裸露以便微電極前列能接觸細(xì)胞,，細(xì)胞的大小也是成功記錄的個(gè)因素，一般選擇10-20um的細(xì)胞比較理想,。膜片鉗技術(shù)是用玻璃微電極吸管把只含1-3個(gè)離子通道,、面積為幾個(gè)平方微米的細(xì)胞膜通過(guò)負(fù)壓吸引封接起來(lái)。進(jìn)口全自動(dòng)膜片鉗實(shí)驗(yàn)操作

鈣成像技術(shù)被廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)元,、心肌以及多種細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子的變化,，從而檢測(cè)神經(jīng)元、心肌的活動(dòng)情況,。這些技術(shù)是人們觀測(cè)神經(jīng)以及多種細(xì)胞活動(dòng)為直接的手段,，現(xiàn)已發(fā)展為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，也是國(guó)家自然科學(xué)基金等鼓勵(lì)申報(bào)的重要領(lǐng)域,。光遺傳學(xué)調(diào)控技術(shù)是近幾年正在迅速發(fā)展的一項(xiàng)整合了光學(xué),、基因操作技術(shù)、電生理等多學(xué)科交叉的生物技術(shù),。NatureMethods雜志將此技術(shù)評(píng)為"Methodoftheyear2010"[19],；美國(guó)麻省理工學(xué)院科技評(píng)述（MITTechnologyReview，2010）在其總結(jié)性文章"Theyearinbiomedicine"中指出：光遺傳學(xué)調(diào)控技術(shù)現(xiàn)已經(jīng)迅速成為生命科學(xué),，特別是神經(jīng)和心臟研究領(lǐng)域中熱門的研究方向之一,。目前這一技術(shù)正在被全球幾百家從事心臟學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和神經(jīng)工程研究的實(shí)驗(yàn)室使用,，幫助科學(xué)家們深入理解大腦的功能,，進(jìn)而為深刻認(rèn)識(shí)神經(jīng),、精神疾病、心血管疾病的發(fā)病機(jī)理并研發(fā)針對(duì)疾病干預(yù)和的新技術(shù),。德國(guó)可升級(jí)膜片鉗電生理工具神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,、腺體的分泌、肌肉的運(yùn)動(dòng),、學(xué)習(xí)和記憶,。

1976年德國(guó)馬普生物物理化學(xué)研究所Neher和Sakmann在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極鉗制膜電位的同時(shí)，記錄到ACh啟動(dòng)的單通道離子電流,，從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù),。1980年Sigworth等在記錄電極內(nèi)施加5-50cmH2O的負(fù)壓吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal）,，明顯降低了記錄時(shí)的噪聲實(shí)現(xiàn)了單根電極既鉗制膜片電位又記錄單通道電流的突破,。1981年Hamill和Neher等對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，引進(jìn)了膜片游離技術(shù)和全細(xì)胞記錄技術(shù),，從而使該技術(shù)更趨完善,，具有1pA的電流靈敏度、1μm的空間分辨率和10μs的時(shí)間分辨率,。1983年10月,，《Single-ChannelRecording》一書問(wèn)世，奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑,。Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出貢獻(xiàn),，榮獲1991年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。

這一設(shè)計(jì)模式似乎幾十年都沒(méi)有改變過(guò),，作為一個(gè)有著近20年膜片鉗經(jīng)驗(yàn)的科研工作者,，記得自己進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室次看到的放大器就差不多是這樣，也不覺(jué)得還會(huì)有什么變化,。直到筆者在19年訪問(wèn)歐洲的一個(gè)同樣做電生理的實(shí)驗(yàn)室的時(shí)候,，發(fā)現(xiàn)了這樣一款獨(dú)特的放大器，讓筆者眼前一亮,，這款放大器從前置放大器出來(lái)的線竟然就直接連接在了電腦上，當(dāng)筆者問(wèn)他們放大器和數(shù)模呢,？他們說(shuō),，你看到的就是全部了，所以的部件都包含在了這個(gè)前置放大器中,。膜片鉗記錄不但能夠在神經(jīng)元胞體及其樹(shù)突上進(jìn)行,，而且可同時(shí)在這兩個(gè)不同的部位作膜片鉗記錄。

電壓鉗的缺點(diǎn)∶電壓鉗技術(shù)目前主要用于巨火細(xì)胞的全細(xì)胞電流研究,，特別在分子克隆的卵母細(xì)胞表達(dá)電流的鑒定中發(fā)揮其它技術(shù)不能替代的作用,。但也有其致命的弱點(diǎn)1,、微電極需刺破細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，以致造成細(xì)胞漿流失,，破壞了細(xì)胞生理功能的完整性;2,、不能測(cè)定單一通道電流。因?yàn)殡妷恒Q制的膜面積很大,，包含著大量隨機(jī)開(kāi)放和關(guān)閉著的通道,，而且背景噪音大，往往掩蓋了單一通道的電流,。3,、對(duì)體積小的細(xì)胞（如哺乳類***元，直徑在10-30μm之間）進(jìn)行電壓鉗實(shí)驗(yàn),，技術(shù)上有更大的困難,。由于電極需插入細(xì)胞，不得不將微電極的前列做得很細(xì),，如此細(xì)的前列致使電極阻抗很大,，常常是60～-8OMΩ或120～150MΩ（取決于不同的充灌液）。這樣大的電極阻抗不利于作細(xì)胞內(nèi)電流鉗或電壓鉗記錄時(shí)在短時(shí)間（0.1μs）內(nèi)向細(xì)胞內(nèi)注入電流,，達(dá)到鉗制膜電壓或膜電流之目的,。再者，在小細(xì)胞上插入的兩根電極可產(chǎn)生電容而降低測(cè)量電壓電極的反應(yīng)能力,。膜片鉗80%的工夫在于刺備細(xì)胞,。進(jìn)口全自動(dòng)膜片鉗實(shí)驗(yàn)操作

脂質(zhì)層電導(dǎo)很低，由于雙分子層的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),，形成了細(xì)胞的膜電容,，通道蛋白開(kāi)閉狀況主要決定了膜電導(dǎo)的數(shù)值。進(jìn)口全自動(dòng)膜片鉗實(shí)驗(yàn)操作

把膜電位鉗位電壓調(diào)到-80--100mV,，再用鉗位放大器的控制鍵把全細(xì)胞瞬態(tài)充電電流調(diào)定至零位（EPC-10的控制鍵稱為C-slow和C-series;Axopatch200標(biāo)為全細(xì)胞電容和系列電阻）,。寫下細(xì)胞的電容值Cc和未補(bǔ)整的系列電阻值Rs，用于消除全細(xì)胞瞬態(tài)電流,，計(jì)算鉗位的固定時(shí)間（即RsCc）,，然啟根據(jù)歐姆定律從測(cè)定脈沖電流的振幅算出細(xì)胞的電阻RC。緩慢調(diào)節(jié)Rs旋鈕注意測(cè)定脈沖反應(yīng)的變化,，逐漸增加補(bǔ)整的比例,。如果RS補(bǔ)整非常接近振蕩的閾值，RS或Cc的微細(xì)變化都會(huì)達(dá)到震蕩的閾值,，產(chǎn)生電壓的振蕩而使細(xì)胞受損,。因此應(yīng)當(dāng)在RS補(bǔ)整水平寫不穩(wěn)定閾值之間留有10%-20%的余地為安全。準(zhǔn)備資料收集和脈沖序列的測(cè)定。進(jìn)口全自動(dòng)膜片鉗實(shí)驗(yàn)操作

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