多束掃描技術(shù)可以同時(shí)對(duì)神經(jīng)元組織的不同位置進(jìn)行成像,。該技術(shù):對(duì)于兩個(gè)遠(yuǎn)程成像位置(相距1-2mm以上),，通常采用兩個(gè)**的路徑進(jìn)行成像；對(duì)于相鄰區(qū)域,，通常使用單個(gè)物鏡的多個(gè)光束進(jìn)行成像,。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_，這可以通過(guò)事后光源分離或時(shí)空復(fù)用來(lái)解決,。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法,；時(shí)空復(fù)用法是指同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束,，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上被延遲，使不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)可以暫時(shí)分離,。引入的光束越多,，可以成像的神經(jīng)元越多，但多束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間重疊增加,，從而限制了分辨信號(hào)源的能力,；并且復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速度要求很高；大量的光束也需要較高的激光功率來(lái)維持單束的信噪比,，這樣容易導(dǎo)致組織損傷,。生產(chǎn)和消費(fèi)的角度分析多光子顯微鏡的主要生產(chǎn)地區(qū)、主要消費(fèi)地區(qū)以及主要的生產(chǎn)商,。嚙齒類(lèi)多光子顯微鏡研究

    細(xì)胞在受到外界刺激時(shí),，隨著刺激時(shí)間的增長(zhǎng)，即使刺激繼續(xù)存在,，Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng),，反而會(huì)減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平,。對(duì)于細(xì)胞受精過(guò)程中Ca2+熒光信號(hào)的變化情況,，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過(guò)程中,，Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化,，而配子之間發(fā)生融合作用時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值,，并可持續(xù)幾分鐘,。這些現(xiàn)象，對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過(guò)程中的作用具有重要的意義,。在其它一些生理過(guò)程如細(xì)胞分裂,、胞吐作用等，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很的變化,。多光子顯微鏡能量脈沖多光子顯微鏡技術(shù)是對(duì)完整組織進(jìn)行深層熒光成像的優(yōu)先技術(shù),。

對(duì)于兩個(gè)遠(yuǎn)距離(相距1-2mm以上)的成像部位，通常采用兩個(gè)**的路徑進(jìn)行成像,；對(duì)于相鄰區(qū)域,，通常使用單個(gè)物鏡的多個(gè)光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_,，這可以通過(guò)事后光源分離或時(shí)空復(fù)用來(lái)解決,。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法；時(shí)空復(fù)用法是指同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束,，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上被延遲,，使不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)可以暫時(shí)分離,。引入的光束越多，可以成像的神經(jīng)元越多,，但多束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間重疊增加,，從而限制了分辨信號(hào)源的能力；并且復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速度要求很高,；大量的光束也需要較高的激光功率來(lái)維持單束的信噪比,，這樣容易導(dǎo)致組織損傷。

Ca2+是重要的第二信使,，對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)具有重要的作用,，開(kāi)發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對(duì)Ca2+熒光信號(hào)進(jìn)行觀測(cè)，可以從某些方面對(duì)有機(jī)體或細(xì)胞的變化機(jī)制進(jìn)行分析,，具有重要的意義。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細(xì)胞內(nèi)用熒光探針標(biāo)記的Ca2*的時(shí)間和空間的熒光圖像的變化,，還可以觀察細(xì)胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化,。通過(guò)對(duì)單細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+不僅在細(xì)胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的,，而且細(xì)胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差,。多光子顯微鏡能提供多種對(duì)比度機(jī)制。

世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國(guó)和日本,，德國(guó)是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為,，而日本以尼康和奧林巴斯公司為，2020年,，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)64.44%的市場(chǎng)份額,，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的走向。目前世界市場(chǎng)對(duì)多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長(zhǎng),，中國(guó)市場(chǎng)這方面的需求增長(zhǎng)更快,，未來(lái)五年多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的發(fā)展在中國(guó)將具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?guó)內(nèi)顯微鏡制造市場(chǎng)目前斷層嚴(yán)重,。目前我國(guó)顯微鏡行業(yè)發(fā)展缺乏技術(shù)沉淀,，20年以上經(jīng)營(yíng)積累的企業(yè)十分稀缺，深度精密制造,、光學(xué)重要部件設(shè)計(jì)及工藝嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)升級(jí),。目前中國(guó)顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統(tǒng),、蔡司,、尼康、奧林巴斯等國(guó)外企業(yè),。國(guó)內(nèi)具備生產(chǎn)顯微鏡能力的企業(yè)屈指可數(shù),，若國(guó)內(nèi)顯微鏡企業(yè)能打破技術(shù)壁壘,，切入顯微鏡市場(chǎng)，企業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)將騰躍至一個(gè)更高的格局,。證實(shí)了多光子顯微鏡對(duì)皮膚和別的皮膚病的診斷的可行性,。共聚焦多光子顯微鏡層析成像

多光子顯微鏡涉及醫(yī)學(xué)、生物學(xué),、化學(xué),、物理學(xué)、電子學(xué),、工程學(xué)等學(xué)科,，生產(chǎn)工藝相對(duì)復(fù)雜，進(jìn)入門(mén)檻較高,。嚙齒類(lèi)多光子顯微鏡研究

要想實(shí)現(xiàn)離散的軸向重新聚焦,，需要在OBJ1的焦平面中放置一個(gè)階梯鏡（圖3b）。當(dāng)入射激光束被OBJ1聚焦到的焦平面恰好與階梯重合時(shí),，被反射的激光將在無(wú)窮大的空間中成為準(zhǔn)直光束,，并在OBJ2的焦平面上形成激光光斑。并且返回的激光束會(huì)被GSM消除橫向掃描,，即OBJ2形成的焦點(diǎn)不會(huì)進(jìn)行橫向掃描,，實(shí)現(xiàn)軸向掃描。如果激光點(diǎn)被掃描到與焦平面不一致的階梯,，則會(huì)形成遠(yuǎn)離鏡面的激光焦點(diǎn),，返回的激光束會(huì)在無(wú)窮大的空間中會(huì)聚或發(fā)散，進(jìn)而導(dǎo)致由OBJ2形成的激光焦點(diǎn)也在軸向重新聚焦,，通過(guò)這種方式即能實(shí)現(xiàn)離散的軸向掃描,。對(duì)于已精確匹配兩個(gè)物鏡光瞳的光學(xué)裝置，不會(huì)引入像差,。為了進(jìn)行連續(xù)的軸向重新聚焦,，將階梯鏡替換為稍微傾斜的平面鏡，同時(shí)入射的激光焦點(diǎn)也需要被傾斜,，使得其以垂直于鏡面的方向入射,，通過(guò)相對(duì)入射激光束稍微平移OBJ1即可實(shí)現(xiàn)這種傾斜。嚙齒類(lèi)多光子顯微鏡研究

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