細(xì)胞在受到外界刺激時,，隨著刺激時間的增長，即使刺激繼續(xù)存在,，Ca2+熒光信號不但不會繼續(xù)增強,，反而會減弱,，直至恢復(fù)到未加刺激物時的水平。對于細(xì)胞受精過程中Ca2+熒光信號的變化情況,，研究發(fā)現(xiàn),，配了在粘著過程中，Ca2+熒光信號未發(fā)生任何變化,，而配子之間發(fā)生融合作用時,，Ca2+熒光信號強度卻會出現(xiàn)一個不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘,。這些現(xiàn)象,，對研究受精發(fā)育的早期信號及Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過程如細(xì)胞分裂,、胞吐作用等,，Ca2+熒光信號強度也會發(fā)生很強的變化。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡,。離體多光子顯微鏡Ultima Investigator

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進步,，特別是隨著后基因組時代的到來，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型,，為在體研究基因表達(dá)規(guī)律,、分子間的相互作用、細(xì)胞的增殖,、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)分化,、細(xì)胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件,。然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法,，已經(jīng)對基因表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用進行了深入,、細(xì)致的研究，但仍然不能實現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動的實時,、動態(tài)監(jiān)測,。在細(xì)胞的生理過程中，基因,、尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá),、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的、動態(tài)的變化,。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化,，但獲取這些信息對與研究基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要。因此,，發(fā)展能用于,、動態(tài)、實時、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動的方法非常必要,。全自動多光子顯微鏡長時間觀察多光子激光掃描顯微鏡已經(jīng)成為了一個活躍且多產(chǎn)的領(lǐng)域,。

快速光柵掃描有多種實現(xiàn)方式，使用振鏡進行快速2D掃描,，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進行快速3D掃描,，但可調(diào)電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換，影響成像速度,，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替,。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實現(xiàn)3D成像的手段，如圖2所示,。在LSU模塊中,，掃描振鏡進行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,，通過調(diào)控M的位置實現(xiàn)軸向掃描,。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進行快速的軸向掃描,。想要獲得更多神經(jīng)元成像,，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計來擴大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大,，無法快速移動以進行快速軸向掃描,，因此大型FOV系統(tǒng)需要依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動透鏡,。

Ca2+是重要的第二信使,，對于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)具有極其重要的作用，開發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對Ca2+熒光信號進行觀測,，可以從某些方面對有機體或細(xì)胞的變化機制進行分析,，具有重要的意義。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細(xì)胞內(nèi)用熒光探針標(biāo)記的Ca2*的時間和空間的熒光圖像的變化,，還可以觀察細(xì)胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化,。通過對單細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+不僅在細(xì)胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的,，而且細(xì)胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差,。全球多光子顯微鏡主要廠商基本情況介紹，包括公司簡介,、多光子顯微鏡產(chǎn)品型號,、產(chǎn)量、產(chǎn)值及動態(tài)等,。

多光子激光掃描顯微鏡的產(chǎn)業(yè)發(fā)展,，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要分布在德國和日本,，德國以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為基礎(chǔ)，日本以尼康和奧林巴斯為基礎(chǔ),。2020年以來,，這些企業(yè)占據(jù)了全球多光子激光掃描顯微鏡市場的64.44%，它們的發(fā)展策略影響著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向,。目前,，世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求正在增長，中國市場的需求增長更快,。未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將仍有巨大的發(fā)展?jié)摿?。帶寬足以覆蓋鈦藍(lán)寶石激光器的可調(diào)諧范圍和用于多光子顯微鏡的許多其它激光器的典型中心頻率。美國熒光多光子顯微鏡代理商

顯微鏡簡史：從光到多光子顯微鏡,。離體多光子顯微鏡Ultima Investigator

2020年,，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中,，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度,。近年來，通過使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電調(diào)諧透鏡(ETL)已經(jīng)實現(xiàn)了快速軸向掃描,。但遠(yuǎn)程對焦時對反射鏡的機械驅(qū)動會限制軸向掃描速度,，ETL會引入球差和高階像差，無法進行高分辨率成像,。為了克服這些限制,，該小組引入了一種新的光學(xué)設(shè)計，可以將橫向掃描轉(zhuǎn)換為無球面像差的軸向掃描,，以實現(xiàn)高分辨率成像,。有兩種方法可以實現(xiàn)這種設(shè)計。***個可以執(zhí)行離散的軸向掃描,，另一個可以執(zhí)行連續(xù)的軸向掃描。如圖3a所示,，特定裝置由兩個垂直臂組成,，每個臂具有4F望遠(yuǎn)鏡和物鏡。遠(yuǎn)程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成,，另一個臂(稱為照明臂)由浸沒物鏡(OBJ2)組成,。兩個臂對齊，使得GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛,。準(zhǔn)直后的激光束經(jīng)偏振分束器反射進入遠(yuǎn)程聚焦臂,，由GSM進行掃描，使OBJ1產(chǎn)生的激光焦點可以進行水平掃描,。離體多光子顯微鏡Ultima Investigator

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