對于雙光子(2P)成像,，散焦和近表面熒光激發(fā)是兩個相對較大的深度限制因素,，而對于三光子(3P)成像，這兩個問題**減少,。  然而,，由于熒光團(tuán)的吸收截面遠(yuǎn)小于2P，三光子成像需要更高的脈沖能量才能獲得與2P相同激發(fā)強(qiáng)度的熒光信號,。  功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡要求更高,，后者需要更快的掃描速度以便及時采樣神經(jīng)元活動,。  為了在每個像素的停留時間內(nèi)收集足夠的信號，需要更高的脈沖能量,。  復(fù)雜的行為通常涉及大規(guī)模的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),，這些網(wǎng)絡(luò)既有本地連接，也有遠(yuǎn)程連接,。  為了將神經(jīng)元的活動與行為聯(lián)系起來,，需要同時監(jiān)測* * *分布的超大型神經(jīng)元的活動。  大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)將在幾十毫秒內(nèi)處理輸入的刺激,。  為了理解這種快速神經(jīng)元動力學(xué),，MPM需要快速成像神經(jīng)元的能力。  快速MPM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù),。  多光子顯微鏡,，突破光學(xué)成像技術(shù)極限，開啟生命科學(xué)新紀(jì)元,。Ultima Investigator多光子顯微鏡研究

    對于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素,，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小,，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號,。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高,，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經(jīng)元活動,；需要更高的脈沖能量,，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接,。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動,，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激,，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學(xué)，就需要MPM具備對神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力,?？焖費PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。 離體多光子顯微鏡成像分辨率高效激發(fā),，長波長照射,，多光子顯微鏡提升樣品存活率。

要想實現(xiàn)離散的軸向重新聚焦,，需要在OBJ1的焦平面中放置一個階梯鏡（圖3b）,。當(dāng)入射激光束被OBJ1聚焦到的焦平面恰好與階梯重合時,，被反射的激光將在無窮大的空間中成為準(zhǔn)直光束，并在OBJ2的焦平面上形成激光光斑,。并且返回的激光束會被GSM消除橫向掃描,，即OBJ2形成的焦點不會進(jìn)行橫向掃描，實現(xiàn)軸向掃描,。如果激光點被掃描到與焦平面不一致的階梯,，則會形成遠(yuǎn)離鏡面的激光焦點，返回的激光束會在無窮大的空間中會聚或發(fā)散,，進(jìn)而導(dǎo)致由OBJ2形成的激光焦點也在軸向重新聚焦,，通過這種方式即能實現(xiàn)離散的軸向掃描。對于已精確匹配兩個物鏡光瞳的光學(xué)裝置,，不會引入像差,。為了進(jìn)行連續(xù)的軸向重新聚焦，將階梯鏡替換為稍微傾斜的平面鏡,，同時入射的激光焦點也需要被傾斜,，使得其以垂直于鏡面的方向入射，通過相對入射激光束稍微平移OBJ1即可實現(xiàn)這種傾斜,。

    2020年,，TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中,，物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度,。近年來，通過使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電可調(diào)諧透鏡（ETL）已經(jīng)實現(xiàn)了快速軸向掃描,；但是,，遠(yuǎn)程聚焦中反射鏡的機(jī)械驅(qū)動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球面像差和更高階像差,，從而無法進(jìn)行高分辨率成像,。為了克服這些局限性，該組引入了一種新穎的光學(xué)設(shè)計,，能將橫向掃描轉(zhuǎn)換為可用于高分辨率成像的無球差的軸向掃描,。該設(shè)計有兩種實現(xiàn)方式，第一種能夠執(zhí)行離散的軸向掃描,，另一種能夠進(jìn)行連續(xù)的軸向掃描,。具體裝置如圖3a所示，由兩個垂直臂組成,，每個臂中都有一個4F望遠(yuǎn)鏡和一個物鏡,。遠(yuǎn)程聚焦臂包含一個檢流掃描鏡（GSM）和一個空氣物鏡（OBJ1），另一個臂（稱為照明臂）由一個水浸物鏡（OBJ2）構(gòu)成。將這兩個臂對齊,，以使GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛,。準(zhǔn)直的激光束被偏振分束器反射到遠(yuǎn)程聚焦臂中，GSM對其進(jìn)行掃描,，進(jìn)而使得OBJ1產(chǎn)生的激光焦點進(jìn)行橫向掃描,。 多光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。

1,，光源,、光路高度整合通過精密的設(shè)計，將飛秒激光器,、掃描振鏡,、PMT、濾光片組,，甚至是單光子熒光光路全套整合在一個不大的掃描頭（ScanHead）內(nèi),，無論掃描頭如何移動，掃描頭內(nèi)的光路都可以保持穩(wěn)定不變,，從而實現(xiàn)了超穩(wěn)定,、免維護(hù)的特點。2,，配合多維度,、高精度機(jī)械控制系統(tǒng)。掃描頭直接架設(shè)在一個多維運(yùn)動的機(jī)械裝置上,，可沿任意方向和角度移動掃描頭，方便對動物樣本進(jìn)行多方位的掃描觀察,。而這在常規(guī)方案的多光子顯微鏡上有很大的實現(xiàn)難度,，不但需要多個關(guān)節(jié)組合的光路導(dǎo)向機(jī)構(gòu)，并且在這些關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)的時候,，都冒著極大的光路偏移的風(fēng)險,，以至于在使用一段時間后都需要對光路進(jìn)行再次校準(zhǔn)，而這樣的問題在我司上則完全不會發(fā)生,。3.一機(jī)多能,。多光子顯微鏡，為疾病診斷和藥物研發(fā)提供強(qiáng)大支持,。美國熒光多光子顯微鏡原理

利用多光子顯微鏡,，進(jìn)行無損、高分辨率的生物組織層析成像,。Ultima Investigator多光子顯微鏡研究

隨著生物分子光學(xué)標(biāo)記技術(shù)的不斷進(jìn)步,，光學(xué)技術(shù)在揭示生命活動基本規(guī)律的研究中正發(fā)揮越來越重要的作用，也為醫(yī)學(xué)診療提供了更多、更有效的手段,。生物醫(yī)學(xué)光學(xué)（BiomedicalOptics）是近年來受到國際光學(xué)界和生物醫(yī)學(xué)界關(guān)注的研究熱點,，在生物活檢、光動力,、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能檢測,、基因表達(dá)規(guī)律的在體研究等問題上取得了一系列研究成果，目前正在從宏觀到微觀上對大腦活動與功能進(jìn)行多層面的研究,。細(xì)胞重大生命活動（包括細(xì)胞增殖,、分化、凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)）的發(fā)生和調(diào)節(jié)是通過生物大分子間（如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì),、蛋白質(zhì)-核酸等）相互作用來實現(xiàn)的,。蛋白質(zhì)作為基因調(diào)控的產(chǎn)物，與細(xì)胞和機(jī)體生理過程代謝直接相關(guān),，深入研究基因表達(dá)及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用不僅能揭示生命活動的基本規(guī)律,，同時也能深入了解疾病發(fā)生的分子機(jī)理，進(jìn)而為尋找更有效的藥物分子,、提高藥物篩選和藥物設(shè)計的效率提供新的方法和思路,。Ultima Investigator多光子顯微鏡研究