單光子激發(fā)熒光的過程,，就是熒光分子吸收一個(gè)光子,，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后,，能量較大的激發(fā)態(tài)分子，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子,，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí),。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí)的分子的平均壽命大約在10s左右。這時(shí)它不是通過內(nèi)轉(zhuǎn)換的方式來消耗能量,，回到基態(tài),，而是通過發(fā)射出相應(yīng)的光量子來釋放能量，回到基態(tài)的各個(gè)不同的振動(dòng)能級(jí)時(shí),，就發(fā)射熒光,。因?yàn)樵诎l(fā)射熒光以前已經(jīng)有一部分能量被消耗，所以發(fā)射的熒光的能量要比吸收的能量小,，也就是熒光的特征波長(zhǎng)要比吸收的特征波長(zhǎng)來的長(zhǎng),。多光子顯微鏡，提高樣品成像質(zhì)量,，降低樣品損害程度,。模塊化多光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)操作

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進(jìn)步，特別是隨著后基因組時(shí)代的到來,，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型,，為在體研究基因表達(dá)規(guī)律、分子間的相互作用,、細(xì)胞的增殖,、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)分化,、細(xì)胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件,。然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法,，已經(jīng)對(duì)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了深入,、細(xì)致的研究，但仍然不能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的實(shí)時(shí),、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),。在細(xì)胞的生理過程中，基因,、尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá),、修飾和相萬(wàn)作用往往發(fā)生可逆的、動(dòng)態(tài)的變化。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化,，但獲取這些信息對(duì)與研究基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要,。因此，發(fā)展能用于,、動(dòng)態(tài),、實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的方法是非常有必要的,。Ultima 2P Plus多光子顯微鏡成像區(qū)域多光子顯微鏡是一款針對(duì)厚樣本進(jìn)行深層成像的利器,特別是在實(shí)驗(yàn)中,。

    對(duì)于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素,，而對(duì)于三光子（3P）成像這兩個(gè)問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào),。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描,，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng),；需要更高的脈沖能量，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào),。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來,，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng),，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué),，就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力,。快速M(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù),。

2020年,，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中,，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度,。近年來，通過使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電調(diào)諧透鏡(ETL)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描,。但遠(yuǎn)程對(duì)焦時(shí)對(duì)反射鏡的機(jī)械驅(qū)動(dòng)會(huì)限制軸向掃描速度,，ETL會(huì)引入球差和高階像差，無(wú)法進(jìn)行高分辨率成像,。為了克服這些限制,，該小組引入了一種新的光學(xué)設(shè)計(jì)，可以將橫向掃描轉(zhuǎn)換為無(wú)球面像差的軸向掃描，以實(shí)現(xiàn)高分辨率成像,。有兩種方法可以實(shí)現(xiàn)這種設(shè)計(jì),。***個(gè)可以執(zhí)行離散的軸向掃描，另一個(gè)可以執(zhí)行連續(xù)的軸向掃描,。如圖3a所示,，特定裝置由兩個(gè)垂直臂組成，每個(gè)臂具有4F望遠(yuǎn)鏡和物鏡,。遠(yuǎn)程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成,，另一個(gè)臂(稱為照明臂)由浸沒物鏡(OBJ2)組成。兩個(gè)臂對(duì)齊,，使得GSM與兩個(gè)物鏡的后焦平面共軛,。準(zhǔn)直后的激光束經(jīng)偏振分束器反射進(jìn)入遠(yuǎn)程聚焦臂，由GSM進(jìn)行掃描,，使OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)可以進(jìn)行水平掃描,。由于雙光子激發(fā)的特性，它可以獲得比傳統(tǒng)顯微鏡更高的分辨率,。

比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出,，基于分子光學(xué)標(biāo)記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達(dá)規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢(shì)。例如,，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實(shí)現(xiàn)對(duì)分子代謝的成像,，空間分辨率∶1-2mm，時(shí)間分辨率;分鐘量級(jí),。與PET比較,，光學(xué)成像的應(yīng)用場(chǎng)合更廣（可測(cè)量更多的參數(shù)，請(qǐng)參見表1-1）,，且具有更高的時(shí)間分辨率（秒級(jí)）,，空間分辨率可達(dá)到微米。因此,，二者相比,，雖然光學(xué)成像在測(cè)量深度方面不及PET，但在測(cè)量參數(shù)種類與時(shí)空分辨率方面有一定優(yōu)勢(shì),。對(duì)于小動(dòng)物（如小白鼠）研究來說,，光學(xué)成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)小動(dòng)物整體成像和在體基因表達(dá)成像。例如,，初步研究表明,，熒光介導(dǎo)層析成像可達(dá)到近10cm的測(cè)量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)在體成像。多光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。美國(guó)靈長(zhǎng)類多光子顯微鏡單分子成像定位

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。模塊化多光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)操作

    2020年,，TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中,，物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度,。近年來，通過使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電可調(diào)諧透鏡（ETL）已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描,；但是,，遠(yuǎn)程聚焦中反射鏡的機(jī)械驅(qū)動(dòng)會(huì)限制軸向掃描速度，ETL會(huì)引入球面像差和更高階像差,，從而無(wú)法進(jìn)行高分辨率成像,。為了克服這些局限性，該組引入了一種新穎的光學(xué)設(shè)計(jì),，能將橫向掃描轉(zhuǎn)換為可用于高分辨率成像的無(wú)球差的軸向掃描,。該設(shè)計(jì)有兩種實(shí)現(xiàn)方式，第一種能夠執(zhí)行離散的軸向掃描,，另一種能夠進(jìn)行連續(xù)的軸向掃描,。具體裝置如圖3a所示，由兩個(gè)垂直臂組成,，每個(gè)臂中都有一個(gè)4F望遠(yuǎn)鏡和一個(gè)物鏡,。遠(yuǎn)程聚焦臂包含一個(gè)檢流掃描鏡（GSM）和一個(gè)空氣物鏡（OBJ1）,，另一個(gè)臂（稱為照明臂）由一個(gè)水浸物鏡（OBJ2）構(gòu)成,。將這兩個(gè)臂對(duì)齊，以使GSM與兩個(gè)物鏡的后焦平面共軛,。準(zhǔn)直的激光束被偏振分束器反射到遠(yuǎn)程聚焦臂中,，GSM對(duì)其進(jìn)行掃描，進(jìn)而使得OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)進(jìn)行橫向掃描,。 模塊化多光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)操作