多束掃描技術(shù)可以同時(shí)對(duì)神經(jīng)元組織的不同位置進(jìn)行成像對(duì)兩個(gè)遠(yuǎn)距離（相距大于1-2mm）的成像部位，通常使用兩條單獨(dú)的路徑進(jìn)行成像,；對(duì)于相鄰區(qū)域,，通常使用單個(gè)物鏡的多光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_問題,，這個(gè)問題可以通過事后光源分離方法或時(shí)空復(fù)用方法來解決,。事后光源分離方法指的是用算法來分離光束消除串?dāng)_；時(shí)空復(fù)用方法指的是同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束,，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上延遲,，這樣就可以暫時(shí)分離被不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)。引入越多路光束就可以對(duì)越多的神經(jīng)元進(jìn)行成像,，但是多路光束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間的重疊增加,，從而限制了區(qū)分信號(hào)源的能力；并且多路復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速率有很高的要求,；大量的光束也需要更高的激光功率來維持近似單光束的信噪比,，這會(huì)容易導(dǎo)致組織損傷。多光子顯微鏡技術(shù)是對(duì)完整組織進(jìn)行深層熒光成像的優(yōu)先技術(shù),。bruker多光子顯微鏡長(zhǎng)時(shí)間觀察

1,，光源,、光路高度整合通過精密的設(shè)計(jì)，將飛秒激光器,、掃描振鏡,、PMT、濾光片組,，甚至是單光子熒光光路全套整合在一個(gè)不大的掃描頭內(nèi),，無(wú)論掃描頭如何移動(dòng)，掃描頭內(nèi)的光路都可以保持穩(wěn)定不變,，從而實(shí)現(xiàn)了超穩(wěn)定,、免維護(hù)的特點(diǎn)。2,，配合多維度,、高精度機(jī)械控制系統(tǒng)。掃描頭直接架設(shè)在一個(gè)多維運(yùn)動(dòng)的機(jī)械裝置上,，可沿任意方向和角度移動(dòng)掃描頭,，方便對(duì)動(dòng)物樣本進(jìn)行多方位的掃描觀察。而這在常規(guī)方案的多光子顯微鏡上有很大的實(shí)現(xiàn)難度,，不但需要多個(gè)關(guān)節(jié)組合的光路導(dǎo)向機(jī)構(gòu),，并且在這些關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)的時(shí)候，都冒著極大的光路偏移的風(fēng)險(xiǎn),，以至于在使用一段時(shí)間后都需要對(duì)光路進(jìn)行再次校準(zhǔn),，而這樣的問題在我司上則完全不會(huì)發(fā)生。3.一機(jī)多能,。多光子顯微鏡暗場(chǎng)成像多光子顯微鏡能提供多種對(duì)比度機(jī)制,。

    細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)，隨著刺激時(shí)間的增長(zhǎng),，即使刺激繼續(xù)存在,，Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng)，反而會(huì)減弱,，直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平。對(duì)于細(xì)胞受精過程中Ca2+熒光信號(hào)的變化情況,，研究發(fā)現(xiàn),，配了在粘著過程中，Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化,，而配子之間發(fā)生融合作用時(shí),，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘,。這些現(xiàn)象,，對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義,。在其它一些生理過程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等,，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很的變化,。

當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，隨著刺激時(shí)間的增加,，即使繼續(xù)刺激,，Ca2+熒光信號(hào)也不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng)，反而會(huì)減弱,，直至恢復(fù)到無(wú)刺激時(shí)的水平,。對(duì)于細(xì)胞受精過程中Ca2+熒光信號(hào)的變化，發(fā)現(xiàn)粘附過程中Ca2+熒光信號(hào)沒有變化,，但當(dāng)配子融合時(shí),，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值，持續(xù)數(shù)分鐘,。這些現(xiàn)象對(duì)于研究受精發(fā)育的早期信號(hào)以及Ca2+在卵子和受精卵發(fā)育中的作用具有重要意義,。在其他生理過程中，如細(xì)胞分裂和胞吐,，Ca2+熒光信號(hào)的強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很大的變化,。目前中國(guó)顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等,。

對(duì)于兩個(gè)遠(yuǎn)距離(相距1-2mm以上)的成像部位,，通常采用兩個(gè)**的路徑進(jìn)行成像；對(duì)于相鄰區(qū)域,，通常使用單個(gè)物鏡的多個(gè)光束進(jìn)行成像,。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_，這可以通過事后光源分離或時(shí)空復(fù)用來解決,。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法,；時(shí)空復(fù)用法是指同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上被延遲,，使不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)可以暫時(shí)分離,。引入的光束越多，可以成像的神經(jīng)元越多,，但多束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間重疊增加,，從而限制了分辨信號(hào)源的能力；并且復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速度要求很高,；大量的光束也需要較高的激光功率來維持單束的信噪比,，這樣容易導(dǎo)致組織損傷。顯微鏡簡(jiǎn)史：從光到多光子顯微鏡。美國(guó)共聚焦多光子顯微鏡成像區(qū)域

多光子顯微鏡市場(chǎng)集中,，由于投產(chǎn)生產(chǎn)的成本較高,，技術(shù)難度大，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多,。bruker多光子顯微鏡長(zhǎng)時(shí)間觀察

快速光柵掃描有多種實(shí)現(xiàn)方式,，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描，將振鏡和可調(diào)電動(dòng)透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描,，但可調(diào)電動(dòng)透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無(wú)法快速進(jìn)行焦點(diǎn)切換,，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替,。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實(shí)現(xiàn)3D成像的手段,。在LSU模塊中，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描,，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,，通過調(diào)控M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差,，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描,。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來擴(kuò)大FOV,，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大,，無(wú)法快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦,、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡,。bruker多光子顯微鏡長(zhǎng)時(shí)間觀察