生物樣品的三維觀察是了解細胞功能的重要方法之一,。目前已有的三維熒光成像技術(shù)有光學顯微鏡、點陣照明和激光掃描顯微鏡(如共焦顯微鏡和雙光子顯微鏡),。其中,，激光掃描顯微鏡利用轉(zhuǎn)盤可以進行多焦點激光掃描，提高了時間分辨率,，有利于減少活細胞成像中的光損傷,。本文主要實現(xiàn)可見光雙光子激發(fā)和多焦點激光掃描的結(jié)合，**終提高三維延遲掃描中的空間分辨率和成像對比度,，這也是可見光雙光子激發(fā)(v2PE)在超高分辨率顯微鏡中的應用,。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進行有生命體成像。國內(nèi)雙光子顯微鏡授權(quán)供應商

細胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性,。當個細胞興奮時,，產(chǎn)生了一個電沖動，此時，細胞外的鈣離子流入該細胞內(nèi),，促使該細胞分泌神經(jīng)遞質(zhì),，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級神經(jīng)細胞產(chǎn)生新的電沖動,。以此類推,，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去，從而構(gòu)成復雜的信號體系,，終形成學習,、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中,，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色,。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍,，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少,。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學活性,，而細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定,，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種,，其中包括電壓門控鈣離子通道,、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等,。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來,，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時去觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細胞,。國外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡價位雙光子顯微鏡明日之星--FemtoFiber ultra 920 ,。

2020年，臨研所,、病理科和科研處邀請北京大學王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學術(shù)報告,。學術(shù)報告由臨研所醫(yī)學實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民,，北京大學信息科學技術(shù)學院副教授,，畢業(yè)于北京大學物理系，獲學士,、碩士學位,，后于英國巴斯大學物理系獲博士學位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,，該成果獲得了2017年度“中國光學進展”和“中國科學進展”,，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前,，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應用,，為未來即時病理、離體組織檢測,、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法,。

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發(fā)激光進入更深的層面,，大致可從兩個方面入手,，裝置優(yōu)化與標本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細,，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深,。關(guān)于標本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個問題,，我們需要對樣本進行透明化處理,。一種方法是運用某種物質(zhì)將標本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解,，讓標本的“透明度”提高。雙光子顯微鏡已延伸到各個領域研究中,，它能對樣品進行三維觀察,。

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺較左邊,?？茖W家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長的波長,，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米,，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。國外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡價位

于雙光子激發(fā)需要兩個光子同時到達,，因此只有在焦點附近的樣品區(qū)域才會激發(fā),，從而實現(xiàn)三維成像和高分辨率。國內(nèi)雙光子顯微鏡授權(quán)供應商

隨著技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升,。要想讓激發(fā)激光進入更深的層面,，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標本改造,。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深,。關(guān)于標本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個問題,，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，進而讓標本“透明度”提高,。國內(nèi)雙光子顯微鏡授權(quán)供應商