王愛民副教授結(jié)合工作實例，展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應(yīng)用,。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn),，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，重量只為2.2克,，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰,、穩(wěn)定的圖像，該顯微鏡適于佩戴在小動物頭部,，可實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元,、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號，在大型動物上,，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴,、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景,，首先雙光子顯微鏡能夠進行細胞和組織結(jié)構(gòu)成像,，在亞微米級成像，此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似,；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r,、在體、原位,、無創(chuàng)地,，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性，區(qū)分成像,；雙光子顯微鏡能夠進行生化指標(biāo)成像,，在無造影劑的前提下，利用自發(fā)熒光,、二次諧波,、熒光獲得活細胞生化信息。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器,。進口bruker雙光子顯微鏡光刺激

在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達到250到500微米,，甚至超過1毫米。另外,，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像,。國外激光雙光子顯微鏡授權(quán)商雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點,，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢？

摻雜可以明顯影響碳點（CDs）的發(fā)射和激發(fā)特性,，使雙光子碳點（TP-CDs）具有本征雙光子激發(fā)特性和605nm的紅光發(fā)射特性,。在638nm激光照射下，除了長波激發(fā)和發(fā)射外,，還可以實現(xiàn)活性氧（ROS）的產(chǎn)生,，這為光動力技術(shù)提供了巨大的可能性。更重要的是,，通過各種表征和理論模擬證實,，摻雜誘導(dǎo)的N雜環(huán)在TP-CDs與RNA的親和力中起關(guān)鍵作用。這種親和力不僅為實現(xiàn)核仁特異性自我靶向提供了可能,，而且通過ROS斷裂RNA鏈解離TP-CDs@RNA復(fù)合物,，賦予治療過程中的熒光變異。TP-CDs結(jié)合了ROS的產(chǎn)生能力,、光動力療法（PDT）過程中的熒光變化,、長波激發(fā)和發(fā)射特性以及核仁的特異性自靶向性，可以認為是一種結(jié)合核仁動態(tài)變化實時處理的智能CDs,。

利用鈣成像技術(shù)記錄大腦活動,，隨著功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展，神經(jīng)學(xué)家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)部的工作情況,。功能鈣成像技術(shù)就是其中之一,，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現(xiàn)象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細胞內(nèi)游離鈣離子濃度，以此細胞的功能狀態(tài),。目前它被廣泛應(yīng)用于實時監(jiān)測一群相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化,，從而判斷其功能活動。該技術(shù)的出現(xiàn)使得科學(xué)家可以親眼目睹神經(jīng)信號在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中時間和空間上的傳遞穿梭,。雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子技術(shù)和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡,。

細胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性,。當(dāng)個細胞興奮時，產(chǎn)生了一個電沖動,，此時,，細胞外的鈣離子流入該細胞內(nèi)，促使該細胞分泌神經(jīng)遞質(zhì),，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細胞膜上的蛋白分子結(jié)合,，促使這一級神經(jīng)細胞產(chǎn)生新的電沖動。以此類推,，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號體系,，終形成學(xué)習(xí),、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中,，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色,。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍,，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少,。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性,，而細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定,，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種,，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體,、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等,。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來,，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細胞,。雙光子顯微鏡結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡。進口激光雙光子顯微鏡光損傷

雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光,，是通過物鏡匯聚的。進口bruker雙光子顯微鏡光刺激

光學(xué)顯微鏡從1590年發(fā)明以來，不斷發(fā)展,，促進生命科學(xué)日新月異的發(fā)現(xiàn),，幫助人類逐層打開生命本質(zhì)的大門。同時,，生命科學(xué)的發(fā)展不斷給光學(xué)顯微鏡提出新的要求，促使成像理論和技術(shù)持續(xù)更新迭代,。科學(xué)進入21世紀(jì),，人們已經(jīng)不滿足于在體外研究細胞和組織，需要能夠更真實地探索生命,，在體內(nèi)實時觀察細胞的發(fā)生和變化,。此時,，雙光子顯微鏡進入了科學(xué)家的視野。在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子,，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（圖1）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時,，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光,。進口bruker雙光子顯微鏡光刺激