在多光子顯微鏡（也稱為非線性或雙光子顯微鏡）中，以兩倍正常激發(fā)波長(zhǎng)照射樣品,。更長(zhǎng)的波長(zhǎng)是有利的,，因?yàn)樗鼈兛梢愿畹卮┩笜悠愤M(jìn)行3D成像，并且因?yàn)樗鼈儾粫?huì)損壞樣品,，從而延長(zhǎng)樣品壽命,。為了實(shí)現(xiàn)多光子激發(fā)，照明光束在空間上聚焦（使用光學(xué)器件）,，同時(shí)使用高能短脈沖激發(fā)光束以提高兩個(gè)（或更多）光子同時(shí)到達(dá)同一位置（即熒光團(tuán)分子）的概率,。多光子顯微技術(shù)的例子包括二次諧波產(chǎn)生(SHG)、三次諧波產(chǎn)生(THG),、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)和受激發(fā)射耗盡(STED)顯微技術(shù),。由于這些技術(shù)中的每一種都使用脈沖激光器，因此選擇能夠比較大限度地減少脈沖色散的光學(xué)組件很重要,，并且激光反射二向色鏡應(yīng)具有低GDD特性,。OCT可以用于損傷修復(fù)監(jiān)測(cè)。Yeh等用OCT,、多光子顯微鏡,。進(jìn)口多光子顯微鏡方案

多束掃描技術(shù)可以同時(shí)對(duì)神經(jīng)元組織的不同位置進(jìn)行成像。該技術(shù):對(duì)于兩個(gè)遠(yuǎn)程成像位置(相距1-2mm以上),，通常采用兩個(gè)**的路徑進(jìn)行成像,；對(duì)于相鄰區(qū)域，通常使用單個(gè)物鏡的多個(gè)光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_,，這可以通過(guò)事后光源分離或時(shí)空復(fù)用來(lái)解決,。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法；時(shí)空復(fù)用法是指同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束,，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上被延遲,，使不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)可以暫時(shí)分離。引入的光束越多,，可以成像的神經(jīng)元越多,，但多束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間重疊增加，從而限制了分辨信號(hào)源的能力,；并且復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速度要求很高,；大量的光束也需要較高的激光功率來(lái)維持單束的信噪比，這樣容易導(dǎo)致組織損傷,。美國(guó)飛秒激光多光子顯微鏡Ultima Investigator全球多光子顯微鏡主要生產(chǎn)地區(qū)分析,，包括產(chǎn)量、產(chǎn)值份額等,。

多光子顯微鏡對(duì)成像深度的改善利用紅光或紅外光激發(fā),，光散射小（小粒子的散射與波長(zhǎng)的四次方的成反比）,。不需要***,，能更多收集來(lái)自成像截面的散射光子。***不能區(qū)分由離焦區(qū)域或焦點(diǎn)區(qū)發(fā)射出的散射光子,，多光子在深層成像信噪比好,。單光子激發(fā)所用的紫外或可見(jiàn)光在光束到達(dá)焦平面之前易被樣品吸收而衰減，不易對(duì)深層激發(fā),。多光子熒光成像的特點(diǎn),。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對(duì)厚散射物質(zhì)成像。信噪比∶多光子吸收采用的波長(zhǎng)是單光子吸收的2倍以上,，所以顯微試樣中的瑞利散射更小,，熒光測(cè)定的信噪比更高。觀察活細(xì)胞∶離子測(cè)量（i.e.Ca2+）,，GFP，發(fā)育生物學(xué)等—減少了光毒性和光漂白,，能對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間觀察,。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進(jìn)步，特別是隨著后基因組時(shí)代的到來(lái),，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型,，為在體研究基因表達(dá)規(guī)律、分子間的相互作用、細(xì)胞的增殖,、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),、誘導(dǎo)分化、細(xì)胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件,。然而,，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法，已經(jīng)對(duì)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了深入,、細(xì)致的研究,，但仍然不能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),。在細(xì)胞的生理過(guò)程中,，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá),、修飾和相萬(wàn)作用往往發(fā)生可逆的,、動(dòng)態(tài)的變化。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化,，但獲取這些信息對(duì)與研究基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要,。因此，發(fā)展能用于,、動(dòng)態(tài),、實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的方法非常必要,。多光子顯微鏡之類的先進(jìn)光學(xué)技術(shù)能夠在活生物體的大腦表面下更深地成像,。

對(duì)于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素,，而對(duì)于三光子成像這兩個(gè)問(wèn)題大大減小,，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào),。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高,，它需要更快速的掃描，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng),；需要更高的脈沖能量,，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào)。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接,。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來(lái)，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng),，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激,，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué),，就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力?？焖費(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù),。多光子激光掃描顯微鏡采用波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紅外激光,能量脈沖式激發(fā),紅外光比可見(jiàn)光在生物組織中的穿透力更強(qiáng)。美國(guó)離體多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位

多光子顯微鏡的成熟的深部組織成像技術(shù)中,。還有其他類型的圖像對(duì)比提供有關(guān)樣本的有價(jià)值信息,。進(jìn)口多光子顯微鏡方案

光學(xué)成像技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合為研究上述科學(xué)問(wèn)題提供了條件與可能。因此,，在現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上,，急需發(fā)展新的成像技術(shù)。在動(dòng)物體內(nèi),，如何實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)之間相五作用的實(shí)時(shí)在體成像監(jiān)測(cè)是當(dāng)前迫切需要解決的重大科學(xué)技術(shù)問(wèn)題,。這是也生物學(xué)、信息科學(xué)（光學(xué)）和基礎(chǔ)臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科共同感興趣的重大問(wèn)題,。對(duì)這-一一科學(xué)問(wèn)題的研究不僅有助于闡明生命活動(dòng)的基本規(guī)律,、認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)展規(guī)律，而且對(duì)創(chuàng)新藥物研究,、藥物療效評(píng)價(jià)以及發(fā)展疾病早期診斷技術(shù)等產(chǎn)生重大影響,。進(jìn)口多光子顯微鏡方案