雙光子技術(shù)在醫(yī)療診斷應(yīng)用中具有巨大的潛力，該領(lǐng)域還未形成標準和體系,，還仍需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究與龐大的醫(yī)療數(shù)據(jù)加以支撐,，通過研究人體基于多光子成像技術(shù)，進行細胞結(jié)構(gòu),、生化成分,、微環(huán)境、組織形態(tài),、代謝功能的影響信息,，找到與疾病的細胞學(xué)、分子生物學(xué),、組織病理學(xué),、診斷和特征的關(guān)聯(lián)關(guān)系，共同探究生理病理基礎(chǔ)和分子細胞生物學(xué)機制,，篩選鑒定,、皮膚病、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據(jù),，建立全新的多光子細胞診斷的完整數(shù)據(jù)庫,，定義出針對不同疾病的多光子臨床檢測設(shè)備的產(chǎn)品標準。討論環(huán)節(jié),，來自病理科,、呼吸中心、心臟科,、神經(jīng)科,、皮膚科及研究所的多位醫(yī)師及研究人員紛紛結(jié)合各自的工作領(lǐng)域與王愛民副教授展開了熱烈的討論,，其中毛發(fā)中心楊頂權(quán)主任計劃再次邀請王愛民副教授進行學(xué)術(shù)交流。通過本次學(xué)術(shù)交流,，病理科與研究所分別與王愛民副教授課題組達成了初步的合作意向,。雙光子顯微鏡的原理是什么？國外熒光激光雙光子顯微鏡光毒性

雙光子顯微鏡的應(yīng)用由于適合動態(tài)成像,，雙光子顯微鏡一經(jīng)問世便很快應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué),、遺傳發(fā)育、藥物代謝等領(lǐng)域,。雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對***神經(jīng)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),、離子濃度、細胞運動,、分子相互作用等進行直接成像監(jiān)測,，而且能夠進行光裂解、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱,。同時,，雙光子顯微鏡能動態(tài)監(jiān)測**在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移，并可對**治療過程中*細胞的變化進行實時觀測和評估,。隨著光學(xué)技術(shù),、熒光探針技術(shù)、計算機成像技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微技術(shù)會得到更大提升和更廣的應(yīng)用,，未來不僅用于基礎(chǔ)研究，也將擴展到臨床應(yīng)用,。激光熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無須使用孔限制光學(xué)散射,。

高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達到80至100兆赫,，這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,，又能不損傷細胞，使掃描能更好地進行,。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實例生物領(lǐng)域：貝爾實驗室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子動力學(xué)情形,。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。信息領(lǐng)域：美國科學(xué)家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲存擴展到三維空間,。由于雙光子激發(fā)具有作用精細體積小的特點,，避免了層與層之間的互相干擾，極大地提高了數(shù)據(jù)儲存密度,。

指示劑是如何負載細胞,，目前有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法,，且都可以用于體內(nèi)和體外研究。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個神經(jīng)元中,。此方法方便實驗者控制單個神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高,。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負載神經(jīng)元，觀察對象為一群神經(jīng)元,。盡管此方法可能導(dǎo)致一些膠質(zhì)細胞也被指示劑所標記,，但明顯提高了整體神經(jīng)元的標記百分比，使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動作電位相關(guān)性的活動,。第三種也較為常用,，通過病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑。（A）單細胞注射法,；（B）networkloading法；（C）通過病毒轉(zhuǎn)染使其基因編碼鈣離子指示劑（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用,。

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用,。幾年前雙光子**過期后,，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上。即便如此,，世界上很多實驗室都搭雙光子,，自己搭的好處有很多，首先是便宜,，尤其是實驗室已經(jīng)有飛秒激光器,，那就更很省錢了。其次是靈活,，可以選擇針對特殊用途的搭配,，改動也靈活。結(jié)束后的好處就是可以鍛煉隊伍,，一趟走下來可以把新手帶出來,，后期維護也更加自由。當然壞處也不少,，首先是操心,，特別是第1次搭的時候，開始要想方案,，后來要解決各種實際問題,。其次是花時間，加上買配件的時間,，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章,，各種protocol，大多是老外寫的,，中文的較少,。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的，尤其是沒有經(jīng)驗的時候,，容易走彎路,，多花錢，也多花時間,，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買,，在國內(nèi)買這些東西耗時較長。因此,，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗,，貼出來分享，希望能幫到想自己動手的實驗室優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),。美國激光熒光雙光子顯微鏡熒光探測

雙光子顯微鏡還可以對一些具有特性的染料細胞進行實驗,，還有一些短波長可以利用雙光子特性進行特定實驗。國外熒光激光雙光子顯微鏡光毒性

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像,，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢,？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點,，何況一臺儀器呢,，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品，對于厚的或者樣品不能進拍攝,；2.共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描,，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅,；3.由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面,，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發(fā),，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗,，效率非常低。國外熒光激光雙光子顯微鏡光毒性