在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中,，來自標(biāo)本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上,，所以其成像是整個樣品的重疊像，沒有縱向分辨能力,。單光子激光共聚焦顯微鏡用針空有效濾除了雜散光,，分辨率有了本質(zhì)上的提高，擁有了對樣品的特定焦平面精細(xì)成像的能力,，可以進(jìn)行三維成像,、動態(tài)成像等。然而,，針空在濾除雜散光的同時(shí)也將大部分來自焦平面的熒光濾除了,，只有很弱的熒光到達(dá)檢測器。若要提高信號強(qiáng)度,，需要加大激發(fā)光功率,，這又會導(dǎo)致對活細(xì)胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡蕞大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),，與單光子共聚焦顯微鏡蕞大的不同在于無須使用針空限制光學(xué)散射,，其具體優(yōu)勢如下所述。上海雙光子顯微鏡就找因斯蔻浦,。美國激光雙光子顯微鏡授權(quán)商

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時(shí)間對活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時(shí)吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。下面是兩種技術(shù)的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米,，甚至超過1毫米,。另外，同時(shí)吸收兩個光子意味只有度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像。進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡分辨率是多少雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行光裂解,、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱,。

1990年初,，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時(shí)，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書,，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用,。當(dāng)時(shí)，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強(qiáng)大的紫外激光器和光學(xué)元件,，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,，換言之，與其通過一個紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子,，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光,。有了想法后馬上實(shí)驗(yàn)。借了一套染料飛秒激光器,，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時(shí)就完成了實(shí)驗(yàn)搭建,，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了,。

實(shí)驗(yàn)從理論和實(shí)驗(yàn)上評估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡的空間分辨率,，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對比，實(shí)驗(yàn)中v2PE的激發(fā)波長為521nm,，使用放大倍率為100倍的物鏡,，尺寸為0.6AU，對直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測試性成像,，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像,。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177nm和297nm，這些值接近顯微鏡的理論分辨率,。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點(diǎn)v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率,，模擬計(jì)算顯示v2PE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似，軸向的半高寬較1PE減少,，可以提高空間分辨率,。雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點(diǎn)，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢,？

在該自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡中,，她們將空間光位相調(diào)制器光學(xué)共軛到顯微物鏡的后焦平面，通過位相調(diào)制器將入射光分成若干子區(qū)域,，每一塊子區(qū)域的波前都可以被控制,。同時(shí)，她們用數(shù)字微陣列光處理器,，以不同的頻率同時(shí)調(diào)制其中一半子區(qū)域的入射光強(qiáng)度,，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”。來自所有子區(qū)域光束會在焦點(diǎn)處會聚干涉,，通過監(jiān)測焦點(diǎn)激發(fā)的雙光子信號隨時(shí)間的變化情況,，并進(jìn)行傅里葉變換分析,，可以“分解”得到被調(diào)制的每一塊子區(qū)域的“光線”的貢獻(xiàn)信息，從而可以實(shí)現(xiàn)對一半子區(qū)域波前的并行測量,。對另一半子區(qū)域重復(fù)這一測量過程,，從而獲得整個入射波前的信息并進(jìn)行校正。該方法耗時(shí)很短,，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正,，無需復(fù)雜的計(jì)算，適用于任何標(biāo)記密度和標(biāo)記類型的樣品,。更重要的是,，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內(nèi)的成像質(zhì)量。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物,、醫(yī)學(xué)問題提供了可行性方案,。雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無須使用孔限制光學(xué)散射。進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡分辨率是多少

雙光子顯微鏡的探測器,該怎么選用?美國激光雙光子顯微鏡授權(quán)商

雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個波長較長的光子，經(jīng)過短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后,，發(fā)射一個波長較短的光子,；效果和用波長為長波長一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優(yōu)點(diǎn)是具有更深的組織穿透深度,，紅外光可以在平面上探測到極限為1mm的組織區(qū)域,；因?yàn)樾盘柋尘氨雀撸跃哂懈叩膶Ρ榷?；由于激發(fā)體積小,，具有定點(diǎn)激發(fā),、光毒性小的特點(diǎn),；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，更加安全,。美國激光雙光子顯微鏡授權(quán)商