隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化,。結(jié)合其特點,，大致可以分為兩個方面:深入和主動改進(jìn)。為了使激發(fā)激光進(jìn)入更深的層次,，可以從器件優(yōu)化和標(biāo)本改造兩個方面入手,。關(guān)于器件的優(yōu)化，我們可以把激光束做得更細(xì),，集中能量,，讓激光穿透得更深。對于樣品,，物質(zhì)的吸收和散射是影響光傳播的主要因素,。為了解決這個問題，我們需要將樣本透明化,。一種方法是用某種物質(zhì)浸泡標(biāo)本,，使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類,，從而提高標(biāo)本的“透明度”,。雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的成像研究,。美國雙光子顯微鏡光刺激

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。下面是兩種技術(shù)的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米,，甚至超過1毫米,。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像。國外2PPLUS雙光子顯微鏡原理優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),。

在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子,，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（如下圖）,。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時,，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時，可采用750nm的激發(fā)光得到450nm熒光,。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。

臨研所,、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授在2020年12月22日做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報告,。學(xué)術(shù)報告由臨研所醫(yī)學(xué)實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士、碩士學(xué)位,，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”,，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前,，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來即時病理、離體組織檢測,、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法,。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用。

在深度組織中以較長時間對活細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達(dá)到250到500微米,，甚至超過1毫米。另外,，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像,。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器,。國內(nèi)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡作用

雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。美國雙光子顯微鏡光刺激

通過對顯微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計,，將FHIRM-TPM2.0的成像視場擴展至420×420平方微米,，顯微物鏡的工作距離擴展至1mm，實現(xiàn)無創(chuàng)成像。嵌入可拆卸的快速軸向掃描模塊,，實現(xiàn)深度180微米的三維體成像和多平面快速切換的實時成像,。該模塊由一個快速電動變焦鏡頭和一對中繼鏡頭組成，在不同深度成像時保持放大率恒定,。其中,，變焦模塊重1.8克，科研人員可以根據(jù)實驗要求自由拆卸,。此外,，新型微型成像探頭可以瞬間插拔，極大簡化了實驗操作,，避免了長時間實驗對動物的干擾,。反復(fù)裝卸探針追蹤同批神經(jīng)元時，視場旋轉(zhuǎn)角度小于0.07弧度,，邊界偏差小于35微米,。美國雙光子顯微鏡光刺激