2020年，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2],。在光學(xué)顯微鏡中,，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度。近年來,，通過使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電調(diào)諧透鏡(ETL)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描,。但遠(yuǎn)程對(duì)焦時(shí)對(duì)反射鏡的機(jī)械驅(qū)動(dòng)會(huì)限制軸向掃描速度，ETL會(huì)引入球差和高階像差,，無法進(jìn)行高分辨率成像,。為了克服這些限制，該小組引入了一種新的光學(xué)設(shè)計(jì),，可以將橫向掃描轉(zhuǎn)換為無球面像差的軸向掃描,，以實(shí)現(xiàn)高分辨率成像。有兩種方法可以實(shí)現(xiàn)這種設(shè)計(jì),。***個(gè)可以執(zhí)行離散的軸向掃描,，另一個(gè)可以執(zhí)行連續(xù)的軸向掃描。如圖3a所示,，特定裝置由兩個(gè)垂直臂組成,，每個(gè)臂具有4F望遠(yuǎn)鏡和物鏡,。遠(yuǎn)程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成，另一個(gè)臂(稱為照明臂)由浸沒物鏡(OBJ2)組成,。兩個(gè)臂對(duì)齊,，使得GSM與兩個(gè)物鏡的后焦平面共軛。準(zhǔn)直后的激光束經(jīng)偏振分束器反射進(jìn)入遠(yuǎn)程聚焦臂,，由GSM進(jìn)行掃描,，使OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)可以進(jìn)行水平掃描。多光子顯微鏡市場(chǎng)集中,，由于投產(chǎn)生產(chǎn)的成本較高,，技術(shù)難度大，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多,。布魯克多光子顯微鏡原理

當(dāng)激光光束焦點(diǎn)的位置在鏡面上,，此時(shí)被反射的激光在無限空間中成為準(zhǔn)直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一個(gè)激光光斑,。同理,，如果橫向掃描光束，則會(huì)形成遠(yuǎn)離傾斜鏡鏡面的焦點(diǎn),，這又導(dǎo)致返回的光束會(huì)聚或發(fā)散,，進(jìn)而OBJ2能在軸向不同位置形成焦點(diǎn)，通過這種方式即能實(shí)現(xiàn)連續(xù)的軸向掃描,。對(duì)于較小的傾斜角,，聚焦沒有球差。該組在實(shí)驗(yàn)中表征了這種將橫向掃描轉(zhuǎn)換為軸向掃描技術(shù)的光學(xué)性能,，并使用它將光片顯微鏡的成像速度提升了一個(gè)數(shù)量級(jí),，從而可以在三個(gè)維度上量化快速的囊泡動(dòng)力學(xué)。該組還演示了使用雙光子光柵掃描顯微鏡以12kHz進(jìn)行共振遠(yuǎn)程聚焦,，該技術(shù)可對(duì)大腦組織和斑馬魚心臟動(dòng)力學(xué)進(jìn)行快速成像,，并具有衍射極限的分辨率。共聚焦多光子顯微鏡層析成像多光子顯微鏡,，為疾病診斷和藥物研發(fā)提供強(qiáng)大支持,。

多光子激發(fā)在紫外成像的優(yōu)勢(shì)在可見光脈沖中能得到紫外衍射的顯微觀察像。即使不使用紫外域光源,、光學(xué)元件用可見光源,、光學(xué)元件就能得到紫外光激勵(lì)的高空間分辨率圖像。多光子在生物成像中的優(yōu)勢(shì)在生物顯微鏡觀察方面,，較早考慮的是不損壞生物本身的活性狀態(tài),，維持水分、離子濃度,、氧和養(yǎng)分的流通,。在光觀察場(chǎng)合,，無論是熱還是光子能量方面都必須停留在細(xì)胞不受損傷的照射量、光能量?jī)?nèi),。多光子顯微鏡則能夠滿足此,，而且還具有很多優(yōu)點(diǎn)。如三維分辨率,、深度侵入,、在散射效率、背景光,、信噪比,、控制等方面，均有以往激光顯微鏡不具備,，或具有無法比擬的超越特性,。

對(duì)于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素,，而對(duì)于三光子（3P）成像這兩個(gè)問題大大減小,，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào),。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高,，它需要更快速的掃描，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng),；需要更高的脈沖能量,，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào)。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來,，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng),，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué),，就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力,。快速M(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù),。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡,。

多光子顯微鏡因擁有較深的成像深度，和較高的對(duì)比度在生物成像中有著重要的意義,，但是它通常需要較高的功率,。結(jié)合時(shí)間上展開的超短脈沖可以實(shí)現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度，但是其本身所利用的近紅外波段的光會(huì)導(dǎo)致分辨率較低,。清華大學(xué)陳宏偉教授和北京大學(xué)席鵬研究員合作研究,，結(jié)合了結(jié)構(gòu)光成像和上轉(zhuǎn)化粒子,，開發(fā)了一種基于多光子上轉(zhuǎn)化材料和時(shí)間編碼結(jié)構(gòu)光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM)。它可以實(shí)現(xiàn)50MHz的超高的掃描速度,，并突破了衍射極限,，實(shí)現(xiàn)了超分辨成像。相較于普通的熒光顯微鏡,，該顯微鏡提升了,，并且只需要較低的激發(fā)功率。這種超快,、低功率,、多光子的超分辨技術(shù)，在分辨率高的生物深層組織成像上有著長(zhǎng)遠(yuǎn)的應(yīng)用前景,。多光子顯微鏡,，實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)、實(shí)時(shí),、動(dòng)態(tài)的生物組織觀測(cè),。共聚焦多光子顯微鏡層析成像

多光子顯微鏡是一種強(qiáng)大的顯微鏡技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿?。布魯克多光子顯微鏡原理

對(duì)于雙光子（2P）成像而言,，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素，而對(duì)于三光子（3P）成像這兩個(gè)問題大大減小,，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào)。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高,，它需要更快速的掃描,，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng)；需要更高的脈沖能量,，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào),。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接,。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來,，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng)，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激,，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué),，就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力?？焖費(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù),。布魯克多光子顯微鏡原理