2020年12月22日,，臨研所,、病理科和科研處邀請(qǐng)北京大學(xué)王愛(ài)民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)潘琳老師主持,。王愛(ài)民,，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，獲學(xué)士,、碩士學(xué)位,，后于英國(guó)巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國(guó)際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)信號(hào),，該成果獲得了2017年度“中國(guó)光學(xué)進(jìn)展”和“中國(guó)科學(xué)進(jìn)展”，并被NatureMethods評(píng)為2018年度“年度方法--無(wú)限制行為動(dòng)物成像”,。目前,，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用，為未來(lái)即時(shí)病理,、離體組織檢測(cè),、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡的應(yīng)用中,，該如何選擇以及更好的使用PMT,。國(guó)外熒光激光雙光子顯微鏡授權(quán)公司

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過(guò)程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過(guò)程,，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小,，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高,。對(duì)于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬,?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源,。這也再次說(shuō)明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰,。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見(jiàn)光波長(zhǎng)),。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì),，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見(jiàn)光穿透更深，對(duì)生物樣品損傷更小,。布魯克雙光子顯微鏡聯(lián)系方式雙光子顯微鏡使用的是可見(jiàn)光或近紅外光作為光源,。

從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆光損傷小：由于雙光子顯微鏡使用的是可見(jiàn)光或近紅外光作為激發(fā)光源,，這一波段的光對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷小,，適用于長(zhǎng)時(shí)間的研究；☆穿透能力強(qiáng)：相對(duì)于紫外光,，可見(jiàn)光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小，解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問(wèn)題,；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長(zhǎng)3次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點(diǎn)處，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象,；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦），這樣就提高了對(duì)熒光的收集率,，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高,；☆圖像對(duì)比度高：由于熒光波長(zhǎng)小于入射波長(zhǎng)，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時(shí)的1/16,，降低了散射的干擾,；☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性，所以可以對(duì)生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像的研究,；

許多生物醫(yī)學(xué)成像方式,，無(wú)論是單光子(共聚焦)或多光子(雙光子)，都使用激光作為光源,，并需要兼容的熒光染料,。熒光染料有自己的激發(fā)波長(zhǎng)，它們可以被單個(gè)光子以該激發(fā)波長(zhǎng)的光子能量激發(fā)(E=hv=h*c/λ);或者是兩個(gè)幾乎同時(shí)到達(dá)的光子,，但每個(gè)光子的能量約為單光子能量的一半,，即雙波長(zhǎng)(0.5E->2λ)。前者是單光子顯微鏡原理,，后者是雙光子顯微鏡原理,。在對(duì)同一種熒光染料進(jìn)行成像時(shí),，雙光子與單光子相比可以使用約兩倍波長(zhǎng)，因此雙光子的散射較小(波長(zhǎng)較長(zhǎng),，散射較小),，可以更深入地滲透到組織中。雙光子顯微鏡角膜成像,。

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢(shì)在于,，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光,，能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域,；因信號(hào)背景比高，而具有更高的對(duì)比度,；因激發(fā)體積小,，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外,、可見(jiàn)光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加地安全,。雙光子顯微鏡知多少,。國(guó)外熒光激光雙光子顯微鏡授權(quán)公司

雙光子顯微鏡已成為較厚有生命體生物組織三維成像中不可或缺的工具。國(guó)外熒光激光雙光子顯微鏡授權(quán)公司

n摻雜可以明顯影響碳點(diǎn)(CDs)的發(fā)射和激發(fā)特性,，使雙光子碳點(diǎn)(TP-CDs)具有本征雙光子激發(fā)特性和605nm紅光發(fā)射特性,。在638nm激光的照射下，除了長(zhǎng)波激發(fā)和發(fā)射外,，還能產(chǎn)生活性氧,，這為光動(dòng)力技術(shù)提供了極大的可能性。更重要的是,，各種表征和理論模擬證實(shí)了摻雜誘導(dǎo)的N雜環(huán)在TP-CDs與RNA的親和力中起著關(guān)鍵作用,。這種親和力不僅可以實(shí)現(xiàn)核仁特異性的自我靶向，還可以通過(guò)ROS斷裂RNA鏈來(lái)解離TP-CDs@RNA復(fù)合物,，從而在治療過(guò)程中產(chǎn)生熒光變化,。TP-CDs結(jié)合了ROS產(chǎn)生的能力、PDT過(guò)程中的熒光變化,、長(zhǎng)波激發(fā)和發(fā)射特性以及核仁特異性自靶向性,，因此可以認(rèn)為是一種實(shí)時(shí)處理核仁動(dòng)態(tài)變化的智能CDs。國(guó)外熒光激光雙光子顯微鏡授權(quán)公司