從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,，這一波段的光對細(xì)胞和組織的光損傷小,，適用于長時(shí)間的研究；☆穿透能力強(qiáng)：相對于紫外光,，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題,；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點(diǎn)處，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象,；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦），這樣就提高了對熒光的收集率,，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高,；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時(shí)的1/16,，降低了散射的干擾,；☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像的研究,；雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器,。進(jìn)口雙光子顯微鏡成像視野是多少

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了,，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用,。幾年前雙光子**過期后，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計(jì)不少于10家以上,。即便如此,，世界上很多實(shí)驗(yàn)室都搭雙光子，自己搭的好處有很多,，首先是便宜,，尤其是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有飛秒激光器，那就更很省錢了,。其次是靈活,，可以選擇針對特殊用途的搭配，改動(dòng)也靈活,。結(jié)束后的好處就是可以鍛煉隊(duì)伍,，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護(hù)也更加自由。當(dāng)然壞處也不少,，首先是操心,，特別是第1次搭的時(shí)候，開始要想方案,，后來要解決各種實(shí)際問題,。其次是花時(shí)間，加上買配件的時(shí)間,，比買一臺(tái)現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時(shí)長?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol,，大多是老外寫的,，中文的較少。其實(shí)完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的,，尤其是沒有經(jīng)驗(yàn)的時(shí)候,，容易走彎路，多花錢,，也多花時(shí)間,，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買，在國內(nèi)買這些東西耗時(shí)較長,。因此,，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗(yàn)，貼出來分享,，希望能幫到想自己動(dòng)手的實(shí)驗(yàn)室美國ultima2PPLUS雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?

在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中,，來自標(biāo)本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上，所以其成像是整個(gè)樣品的重疊像,，沒有縱向分辨能力,。單光子激光共聚焦顯微鏡用針空有效濾除了雜散光，分辨率有了本質(zhì)上的提高,，擁有了對樣品的特定焦平面精細(xì)成像的能力,，可以進(jìn)行三維成像,、動(dòng)態(tài)成像等,。然而，針空在濾除雜散光的同時(shí)也將大部分來自焦平面的熒光濾除了,，只有很弱的熒光到達(dá)檢測器,。若要提高信號(hào)強(qiáng)度，需要加大激發(fā)光功率,，這又會(huì)導(dǎo)致對活細(xì)胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加,。雙光子顯微鏡蕞大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)，與單光子共聚焦顯微鏡蕞大的不同在于無須使用針空限制光學(xué)散射，其具體優(yōu)勢如下所述,。

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像,，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的,，任何事物都有優(yōu)缺點(diǎn),，何況一臺(tái)儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品,，對于厚的或者樣品不能進(jìn)拍攝,；2.共聚焦顯微鏡由于是逐點(diǎn)進(jìn)行掃描，對樣品的光毒性還是比較大的,，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時(shí)就更容易對樣品進(jìn)行淬滅,；3.由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個(gè)Z軸的層面，所以對于空間定點(diǎn)光刺激的實(shí)驗(yàn)定點(diǎn)位置就不是特別精確,；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進(jìn)行激發(fā),，對于一些特殊激發(fā)波長的實(shí)驗(yàn)，效率非常低,。如果已經(jīng)有了飛秒光,，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺(tái)，只需分光即可,。

雙光子顯微鏡是一種先進(jìn)的成像技術(shù),，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞或組織的深層觀察。它的主要特點(diǎn)是使用雙光子激發(fā)來產(chǎn)生熒光,，從而實(shí)現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像,。雙光子顯微鏡的工作原理是利用激光的脈沖寬度極窄的特性，將高能激光束聚焦到生物樣品中,，激發(fā)出熒光,。這個(gè)過程需要使用一個(gè)特殊的雙光子激發(fā)源，它能夠?qū)⒁粋€(gè)光子轉(zhuǎn)換為兩個(gè)光子,，其中一個(gè)光子用于激發(fā)熒光,，另一個(gè)光子則用于成像。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點(diǎn)：高分辨率：由于雙光子激發(fā)的特性,，可以實(shí)現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像,，特別是對于深層組織的觀察。穿透深度大：雙光子激光的波長較長,，能夠更好地穿透生物組織,，從而實(shí)現(xiàn)對深層細(xì)胞的觀察。熒光壽命長：雙光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命比單光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命長,，這使得雙光子顯微鏡能夠更好地區(qū)分不同的熒光標(biāo)記物,。減少光毒性：由于雙光子激發(fā)的能量較低，因此對生物樣品的損傷較小，可以減少光毒性,?？傊p光子顯微鏡是一種非常有用的成像技術(shù),，可以用于生物學(xué),、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究,。雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡,，其原理大致是這樣的；進(jìn)口熒光激光雙光子顯微鏡供應(yīng)商

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TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纖激光器是一種易于操作和免維護(hù)的激光系統(tǒng)其輸出波長為920nm,，非常適合常規(guī)熒光基團(tuán)(如GFP、eGFP,、曙紅,、GCaMP、CFP,、鈣黃綠素或金星)的雙光子激發(fā),。它可以為熒光基團(tuán)提供相對較高的峰值功率，常用于神經(jīng)科學(xué)和其他與激光相關(guān)的光子學(xué),。此外,，其獨(dú)特的設(shè)計(jì)(簡單和經(jīng)濟(jì)的光源)具有創(chuàng)新雙光子熒光顯微鏡發(fā)展的潛力。在雙光子顯微鏡中,，峰值功率就是亮度,！如果你想獲得更好的圖像亮度，那么你需要短脈沖,，高功率,，更重要的是，干凈的時(shí)間脈沖形狀,。FemtoFiberultra920具有足夠高的輸出功率,、短脈沖、獨(dú)特的Clean-Pulse技術(shù)和相對較高的峰值功率,，這使得在雙光子顯微鏡中實(shí)現(xiàn)****亮度而無需對樣品進(jìn)行不必要的加熱成為可能,。FemtoFiberultra920全包式、完全集成的色散補(bǔ)償(可確保樣品處的短脈沖),、內(nèi)置電源控制,、直觀的操作及其堅(jiān)固緊湊的設(shè)計(jì)使系統(tǒng)具有非常友好的用戶體驗(yàn),，是非線性顯微鏡應(yīng)用的良好解決方案,。例如，熒光蛋白的雙光子激發(fā)和基于SHG的對比機(jī)制進(jìn)口雙光子顯微鏡成像視野是多少