使用MPM對神經(jīng)元進(jìn)行成像時(shí)，通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個(gè)視場上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維,，還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間,。隨機(jī)訪問掃描可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實(shí)現(xiàn),，其原理是將具有一個(gè)射頻信號(hào)的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時(shí)發(fā)生衍射。通過射頻電信號(hào)調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向,，這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描，利用1對AOD,，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描,。但是該技術(shù)對樣本的運(yùn)動(dòng)很敏感，易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影,。目前,，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動(dòng)偽影而被普遍的使用,。多光子顯微鏡之類的先進(jìn)光學(xué)技術(shù)能夠在活生物體的大腦表面下更深地成像,。清醒動(dòng)物多光子顯微鏡能量脈沖

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，特別是后基因組時(shí)代的到來,，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型,，這為在體內(nèi)研究基因表達(dá)、分子間相互作用,、細(xì)胞增殖,、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),、誘導(dǎo)分化,、細(xì)胞凋亡和新生血管生成提供了良好的生物學(xué)條件。然而,，盡管利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法對基因表達(dá)與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行了深入細(xì)致的研究,，但仍然無法實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活性的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測。在細(xì)胞的生理過程中,，基因尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá),、修飾和相互作用往往是可逆的、動(dòng)態(tài)變化的,。目前,，分子生物學(xué)方法無法捕捉到蛋白質(zhì)和基因的這些變化,，但獲得這些信息對于研究基因表達(dá)與蛋白質(zhì)的相互作用非常重要。因此,，有必要發(fā)展一種動(dòng)態(tài),、實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活性的方法,。在體多光子顯微鏡峰值功率密度多光子顯微鏡在臨床前評價(jià)IA形態(tài),、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞密度和血管形成等方面顯示出強(qiáng)大的作用,。

單束掃描技術(shù)可以高速遍歷大視場（FOV）的神經(jīng)組織：使用MPM對神經(jīng)元進(jìn)行成像時(shí),，通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個(gè)視場上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維,，還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間,。隨機(jī)訪問掃描（圖1）可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實(shí)現(xiàn)，其原理是將具有一個(gè)射頻信號(hào)的壓電傳感器粘在合適的晶體上,，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵,，激光束通過光柵時(shí)發(fā)生衍射。通過射頻電信號(hào)調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向,，這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描,，利用1對AOD，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描,。但是該技術(shù)對樣本的運(yùn)動(dòng)很敏感,，易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影。目前,，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描,，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動(dòng)偽影而被普遍的使用。

對于雙光子成像而言,，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素,，而對于三光子（3P）成像這兩個(gè)問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào),。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描,，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng),；需要更高的脈沖能量，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào),。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來,，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng),，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激,，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué)，就需要MPM具備對神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力,?？焖費(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。多光子顯微鏡將生物打印結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位和定向到特定的解剖部位,，使其能夠在小鼠組織內(nèi)制造復(fù)雜結(jié)構(gòu),。

多光子成像系統(tǒng)提供的優(yōu)勢包括了真正的三維成像、對活組織內(nèi)部深處進(jìn)行成像的能力以及消除平面外熒光的能力,。使用這種方法進(jìn)行成像,，可以對斯托克斯位移非常短和/或效率非常低的熒光染料進(jìn)行成像，甚至可以對樣品或組織中固有的熒光分子進(jìn)行成像,。多光子成像的缺點(diǎn)包括需要高峰值功率脈沖激光器,，例如鎖模鈦：藍(lán)寶石激光器，并且直到現(xiàn)在,，缺乏在整個(gè)發(fā)射范圍內(nèi)提供足夠吞吐量的高性能濾光片,。整個(gè)激光調(diào)諧范圍內(nèi)的興趣和足夠的阻擋。4tune光譜檢測器,，實(shí)現(xiàn)多光子顯微鏡的光譜型檢測,。美國離體多光子顯微鏡設(shè)備

多光子顯微鏡的分辨率比傳統(tǒng)的單光子共聚焦要低的多。清醒動(dòng)物多光子顯微鏡能量脈沖

在多光子顯微鏡（也稱為非線性或雙光子顯微鏡）中,，以兩倍正常激發(fā)波長照射樣品,。更長的波長是有利的，因?yàn)樗鼈兛梢愿畹卮┩笜悠愤M(jìn)行3D成像,，并且因?yàn)樗鼈儾粫?huì)損壞樣品,，從而延長樣品壽命。為了實(shí)現(xiàn)多光子激發(fā),，照明光束在空間上聚焦（使用光學(xué)器件）,，同時(shí)使用高能短脈沖激發(fā)光束以提高兩個(gè)（或更多）光子同時(shí)到達(dá)同一位置（即熒光團(tuán)分子）的概率。多光子顯微技術(shù)的例子包括二次諧波產(chǎn)生(SHG),、三次諧波產(chǎn)生(THG),、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)和受激發(fā)射耗盡(STED)顯微技術(shù)。由于這些技術(shù)中的每一種都使用脈沖激光器,，因此選擇能夠比較大限度地減少脈沖色散的光學(xué)組件很重要,，并且激光反射二向色鏡應(yīng)具有低GDD特性。清醒動(dòng)物多光子顯微鏡能量脈沖