首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù),。激光掃描共聚焦顯微技術(shù),，是熒光顯微成像的一種,，用于激發(fā)樣品的熒光信號(hào)并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中,，樣品焦平面上每一時(shí)刻只有一個(gè)點(diǎn)被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射,，但通過探測器前的（pinhole）,，有焦平面上的熒光信號(hào)能被探測器接收。也就是說,，每個(gè)時(shí)刻,，只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測。通過點(diǎn)掃描的方式,，一個(gè)個(gè)點(diǎn)的信號(hào)就可以組合出終的圖像,。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點(diǎn)掃描的方式得到圖像。不同的是,，其采用的激發(fā)光波長較長,，只有當(dāng)兩個(gè)（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時(shí)轟擊熒光探針的時(shí)候才可能激發(fā)出熒光信號(hào)。所以只有在光子密度特別大的焦點(diǎn),，出才會(huì)激發(fā)出熒光,。也就是說，雙光子顯微鏡中,，同樣每個(gè)時(shí)刻只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測,，并且連焦平面外的熒光信號(hào)也不會(huì)有。雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無須使用孔限制光學(xué)散射,。進(jìn)口ultimainvestigator雙光子顯微鏡成像原理是什么

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強(qiáng)度,，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高,。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬,。基于以上分析,，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源,。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰,。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小,。國外激光雙光子顯微鏡光毒性雙光子顯微鏡工作原理是利用兩個(gè)光子的能量相加達(dá)到熒光激發(fā)能量閾值，來激發(fā)樣品中熒光分子發(fā)出熒光信號(hào),。

2020年,，臨研所、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告,。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)潘琳老師主持,。王愛民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士、碩士學(xué)位，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)信號(hào)，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”,，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動(dòng)物成像”,。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來即時(shí)病理、離體組織檢測,、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法,。

配合雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效,。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子使電子躍遷到較高能級(jí),，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長為長波長一半的光子（P=h/λ）,。利用這個(gè)原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再次穿過物鏡,，被光探頭接收,，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。雙光子顯微鏡放大倍數(shù)是多少,？

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子使電子躍遷到較高能級(jí),，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后,，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù),。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光,，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡,，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果,。雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行指標(biāo)成像,；國外激光雙光子顯微鏡光毒性

這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍。進(jìn)口ultimainvestigator雙光子顯微鏡成像原理是什么

第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0,，其成像視野是該團(tuán)隊(duì)于2017年發(fā)布的代微型化顯微鏡的7.8倍,，同時(shí)具備三維成像能力，獲取了小鼠在自由運(yùn)動(dòng)行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個(gè)神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)功能圖像,，并且實(shí)現(xiàn)了針對同一批神經(jīng)元長達(dá)一個(gè)月的追蹤記錄,。在一批“早鳥項(xiàng)目”中，該系統(tǒng)已被多個(gè)研究組應(yīng)用于不同的模式動(dòng)物和行為范式,，如小鼠的社交新穎性識(shí)別,、斑胸草雀受調(diào)控后大腦特定神經(jīng)元變化、新型神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿探針的傳導(dǎo)適應(yīng)性分析以及獼猴三腦區(qū)成像等多項(xiàng)研究,。進(jìn)口ultimainvestigator雙光子顯微鏡成像原理是什么