由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度，在我們的實驗中,，時間分辨率主要是受OPO輸出可見光激光功率的限制,。盡管在單點掃描系統(tǒng)中，v2PE激發(fā)會使得空間分辨率提高,，但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率,，這主要是多聚焦成像和單點掃描技術(shù)之間的差異造成的。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE,，引入圖像掃描技術(shù)可以進一步提高空間分辨率,，這種技術(shù)需要通過在陣列前引入額外的微透鏡陣列來實現(xiàn)。除此之外,，由于可見光區(qū)域的共振效應(yīng),，可能會產(chǎn)生光漂白，因而為了延長觀察時間,，系統(tǒng)還需要對激發(fā)強度和曝光時間做進一步優(yōu)化,。雙光子顯微鏡能夠進行光裂解、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱,。美國激光雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商

1990年初,，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書,，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強光和物質(zhì)的相互作用,。當(dāng)時,，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學(xué)元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,，換言之,，與其通過一個紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光,。有了想法后馬上實驗,。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建,，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天,，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。進口bruker雙光子顯微鏡廠家雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用,；

激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式,，采用激光束作光源，激光束經(jīng)照明,，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡,，并聚焦于樣品上，對標(biāo)本焦平面上每一點進行掃描,。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡,，通過探測時先聚焦，然后被光探頭收集,，轉(zhuǎn)化為信號輸送到計算機進行處理,。這個裝置能讓通過探測的只有焦平面上發(fā)出的熒光，使成像更為清晰準(zhǔn)確,，同時通過改變物鏡的焦距,，能對不同焦平面進行掃描，通過計算機繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像,。而配合了雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）,。利用這個原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。

2020年,，臨研所,、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報告,。學(xué)術(shù)報告由臨研所醫(yī)學(xué)實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民,，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，獲學(xué)士,、碩士學(xué)位,，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進展”和“中國科學(xué)進展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”,。目前,，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用，為未來即時病理,、離體組織檢測,、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。

為了驗證動物生物樣品的時間分辨成像能力,，本實驗觀察了活海拉細胞高爾基體中的青色熒光蛋白mTFP1，見圖3(a),(c)-(i),。使用的物鏡及尺寸與熒光顆粒成像一致,，對比可見v2PE在空間分辨率、激發(fā)深度級圖像對比度較常規(guī)寬場顯微鏡都有所提高,。此外,，v2PE可以同時激發(fā)多個波長的熒光蛋白，這種技術(shù)還可以應(yīng)用于細胞內(nèi)分子的三維動力學(xué)多色成像,。在此基礎(chǔ)上,，實驗對海拉細胞中的高爾基體(mTFP1)和纖顫蛋白(EGFP)進行了在體成像，見圖3(j)-(n),，青色為mTFP1,綠色為EGFP,，實驗中兩種熒光蛋白同時成像，終采用光譜分離法將不同蛋白的熒光信號分離出來,。雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點,，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢？ultimainvestigator雙光子顯微鏡分辨率

成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調(diào)焦設(shè)備,；美國激光雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商

在深度組織中以較長時間對活細胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米,，甚至超過1毫米,。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像。美國激光雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商