繼首代小型化雙光子顯微鏡在國(guó)際上獲得小鼠自由行為過程中大腦神經(jīng)元和突觸的動(dòng)態(tài)圖像后,，我們成功研制了第二代小型化雙光子顯微鏡,。它具有更大的成像視野和三維成像能力,，可以清晰穩(wěn)定地對(duì)自由活動(dòng)小鼠三維腦區(qū)的數(shù)千個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行成像,，實(shí)現(xiàn)對(duì)同一批神經(jīng)元的一個(gè)月追蹤記錄。通過對(duì)微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計(jì)系統(tǒng)的,。微物鏡工作距離延長(zhǎng)至1mm,，實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)成像。內(nèi)嵌可拆卸的快速軸向掃描模塊,，可采集深度180微米的3D體成像和多平面快速切換的實(shí)時(shí)成像,。該掃描模塊由一個(gè)快速的電動(dòng)變焦透鏡和一對(duì)中繼透鏡組成，在不同深度成像時(shí)可保持放大倍率恒定,。其變焦模塊重量,，研究人員可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自由拆卸。此外,，新版微型化成像探頭可整體即時(shí)拔插,，極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，避免了長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)動(dòng)物的干擾,。在重復(fù)裝卸探頭同一批神經(jīng)元時(shí),，視場(chǎng)旋轉(zhuǎn)角小于，邊界偏差小于35微米,。 多光子顯微鏡技術(shù)是對(duì)完整組織進(jìn)行深層熒光成像的優(yōu)先技術(shù),。共聚焦多光子顯微鏡Ultima Investigator

多光子顯微鏡對(duì)成像深度的改善利用紅光或紅外光激發(fā)，光散射小（小粒子的散射與波長(zhǎng)的四次方的成反比）,。不需要***,，能更多收集來自成像截面的散射光子。***不能區(qū)分由離焦區(qū)域或焦點(diǎn)區(qū)發(fā)射出的散射光子,，多光子在深層成像信噪比好,。單光子激發(fā)所用的紫外或可見光在光束到達(dá)焦平面之前易被樣品吸收而衰減，不易對(duì)深層激發(fā),。多光子熒光成像的特點(diǎn)。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對(duì)厚散射物質(zhì)成像,。信噪比∶多光子吸收采用的波長(zhǎng)是單光子吸收的2倍以上,，所以顯微試樣中的瑞利散射更小，熒光測(cè)定的信噪比更高,。觀察活細(xì)胞∶離子測(cè)量（i.e.Ca2+）,，GFP，發(fā)育生物學(xué)等—減少了光毒性和光漂白,，能對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間觀察,。美國(guó)熒光多光子顯微鏡成像區(qū)域多光子顯微鏡的成熟的深部組織成像技術(shù)中。還有其他類型的圖像對(duì)比提供有關(guān)樣本的有價(jià)值信息,。

對(duì)兩個(gè)遠(yuǎn)距離（相距大于1-2 mm）的成像部位,，通常使用兩條單獨(dú)的路徑進(jìn)行成像；對(duì)于相鄰區(qū)域,，通常使用單個(gè)物鏡的多光束進(jìn)行成像,。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_問題，這個(gè)問題可以通過事后光源分離方法或時(shí)空復(fù)用方法來解決,。事后光源分離方法指的是用算法來分離光束消除串?dāng)_,；時(shí)空復(fù)用方法指的是同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上延遲,，這樣就可以暫時(shí)分離被不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào),。引入越多路光束就可以對(duì)越多的神經(jīng)元進(jìn)行成像，但是多路光束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間的重疊增加,，從而限制了區(qū)分信號(hào)源的能力,；并且多路復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速率有很高的要求；大量的光束也需要更高的激光功率來維持近似單光束的信噪比,，這會(huì)容易導(dǎo)致組織損傷,。

根據(jù)阿貝成像原理，許多光學(xué)成像系統(tǒng)是一個(gè)低通濾波器,，物平面包含從低頻到高頻的信息,，透鏡口徑會(huì)限制高頻信息通過，只允許一定的低頻通過,，因此丟失了高頻信息會(huì)使成像所得圖像的細(xì)節(jié)變模糊,，降低分辨率,。對(duì)于三維成像來說，寬場(chǎng)照明時(shí)得到的信息不僅包含物鏡焦平面上樣品的部分信息,，同時(shí)還包含焦平面外的樣品信息,。由于受到焦平面外的信息干擾，常規(guī)熒光顯微鏡無法獲得層析圖像,。三維結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡能夠提高分辨率,、獲得層析圖像，是因?yàn)槔锰囟ńY(jié)構(gòu)的照明光能引入樣品的高頻信息,，當(dāng)結(jié)構(gòu)光的空間頻率足夠高時(shí),，只有靠近焦面的部分才能被結(jié)構(gòu)光調(diào)制，超出這一區(qū)域,，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆蛘彰?，也就是只有焦面附近的有限區(qū)域具有相對(duì)完整的頻譜信息，離焦后,，高頻信息迅速衰減,，所以使用高頻結(jié)構(gòu)光照明可以區(qū)分焦面和離焦區(qū)域來獲得層析圖像。然后再通過軸向掃描可以獲取樣品不同深度的焦面圖像,，重建樣品的三維結(jié)構(gòu),。多光子顯微鏡在基礎(chǔ)科學(xué)和臨床診斷領(lǐng)域的應(yīng)用范圍正在持續(xù)增長(zhǎng)。

單光子激發(fā)熒光的過程,，就是熒光分子吸收一個(gè)光子,，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后,，能量較大的激發(fā)態(tài)分子,，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí),。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí)的分子的平均壽命大約在 10s 左右,。這時(shí)它不是通過內(nèi)轉(zhuǎn)換的方式來消耗能量，回到基態(tài),，而是通過發(fā)射出相應(yīng)的光量子來釋放能量,，回到基態(tài)的各個(gè)不同的振動(dòng)能級(jí)時(shí)，就發(fā)射熒光,。因?yàn)樵诎l(fā)射熒光以前已經(jīng)有一部分能量被消耗,，所以發(fā)射的熒光的能量要比吸收的能量小，也就是熒光的特征波長(zhǎng)要比吸收的特征波長(zhǎng)來的長(zhǎng),。多光子顯微鏡已經(jīng)被生物學(xué)家普遍的運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)中,。靈長(zhǎng)類多光子顯微鏡研究

多光子顯微鏡將生物打印結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位和定向到特定的解剖部位，使其能夠在小鼠組織內(nèi)制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)。共聚焦多光子顯微鏡Ultima Investigator

單束掃描技術(shù)可以高速遍歷大視場(chǎng)（FOV）的神經(jīng)組織：使用MPM對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行成像時(shí),，通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個(gè)視場(chǎng)上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元,，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間,。隨機(jī)訪問掃描（圖1）可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實(shí)現(xiàn),，其原理是將具有一個(gè)射頻信號(hào)的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵,，激光束通過光柵時(shí)發(fā)生衍射,。通過射頻電信號(hào)調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向，這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描,，利用1對(duì)AOD,，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描。但是該技術(shù)對(duì)樣本的運(yùn)動(dòng)很敏感,，易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影。目前,，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描,，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動(dòng)偽影而被普遍的使用。共聚焦多光子顯微鏡Ultima Investigator