后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用碘化丙啶(PI)來(lái)指示細(xì)胞在7、8,、9和10分鐘的延時(shí)觀察后的損傷情況,，來(lái)驗(yàn)證該光學(xué)系統(tǒng)對(duì)活細(xì)胞長(zhǎng)期觀察的適用性。在觀察期間,，88個(gè)焦點(diǎn)以100毫秒的曝光時(shí)間,，曝光間隔1s照射樣品,，激發(fā)強(qiáng)度為3.21×104W/cm2,，激發(fā)波長(zhǎng)為525nm,，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖,，(e)-(h)為相應(yīng)的相應(yīng)襯度圖,。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s，得到相應(yīng)的(i)-(p),。由圖像可知,，延時(shí)觀察小于8分鐘的情況下不造成可見(jiàn)細(xì)胞損傷，對(duì)于實(shí)際3D延時(shí)成像,，由于焦平面是移動(dòng)的,，所以預(yù)期細(xì)胞存活時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)，可見(jiàn)這是一種在3D在體延時(shí)成像中具有很大優(yōu)勢(shì)的成像方案,。雙光子顯微鏡廠家就找滔博生物,。美國(guó)2PPLUS雙光子顯微鏡價(jià)格

N摻雜可以明顯影響碳點(diǎn)（CDs）的發(fā)射和激發(fā)特性，使雙光子碳點(diǎn)（TP-CDs）具有本征雙光子激發(fā)特性和605 nm的紅光發(fā)射特性,。在638 nm激光照射下,，除了長(zhǎng)波激發(fā)和發(fā)射外，還可以實(shí)現(xiàn)活性氧（ROS）的產(chǎn)生,，這為光動(dòng)力技術(shù)提供了巨大的可能性,。更重要的是，通過(guò)各種表征和理論模擬證實(shí),，摻雜誘導(dǎo)的N雜環(huán)在TP-CDs與RNA的親和力中起關(guān)鍵作用,。這種親和力不僅為實(shí)現(xiàn)核仁特異性自我靶向提供了可能，而且通過(guò)ROS斷裂RNA鏈解離TP-CDs@RNA復(fù)合物,，賦予治療過(guò)程中的熒光變異,。TP-CDs結(jié)合了ROS的產(chǎn)生能力、光動(dòng)力療法（PDT）過(guò)程中的熒光變化,、長(zhǎng)波激發(fā)和發(fā)射特性以及核仁的特異性自靶向性,，可以認(rèn)為是一種結(jié)合核仁動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)處理的智能CDs。熒光雙光子顯微鏡成像視野這種雙光子顯微鏡的視場(chǎng)是普通顯微鏡的10倍,。

研究人員通過(guò)用不同激光波長(zhǎng)并行化激光掃描（wavelengthmultiplexing）,，增加了相同時(shí)間內(nèi)可以成像的體積，并同時(shí)保持較高的時(shí)間和空間分辨率,。通過(guò)引入兩種波長(zhǎng)不同的鈣信號(hào)熒光探針,，研究人員將神經(jīng)元群體的活動(dòng)標(biāo)記為兩個(gè)不同顏色，并同時(shí)用兩個(gè)不同波長(zhǎng)的激光激發(fā)探針,，實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)顏色的并行化數(shù)據(jù)記錄,。為了實(shí)現(xiàn)三維空間成像,，研究人員還分別在兩個(gè)激光光路上配置了快速變焦系統(tǒng)，分別為電可調(diào)節(jié)透鏡（electricaltunablelens）和空間光調(diào)制器（spatiallightmodulator）,。由此,，可以同時(shí)以10赫茲的速度記錄500微米500微米的10個(gè)平面，覆蓋縱深達(dá)600微米,，涵蓋了從腦皮層第2層到第5層的結(jié)構(gòu),，體積內(nèi)記錄到的神經(jīng)元可以達(dá)到2000個(gè)以上。

在國(guó)家自然科學(xué)基金委國(guó)家重大科研儀器研制專項(xiàng)《超高時(shí)空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下,，北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所,、信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院、動(dòng)態(tài)成像中心,、生命科學(xué)學(xué)院,、工學(xué)院聯(lián)合中國(guó)人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)，歷經(jīng)三年多的協(xié)同奮戰(zhàn),，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡,，并獲取了小鼠在自由行為過(guò)程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)清晰、穩(wěn)定的圖像,。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊Nature Methods (IF 25.3),，相關(guān)技術(shù)文檔同步發(fā)表于Protocol Exchange (DOI: 10.1038/protex.2017.048)，并已申請(qǐng)多項(xiàng),。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行有生命體成像,。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過(guò)激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記,，使用探測(cè)器測(cè)量被激發(fā)的熒光。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過(guò)單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器,，通過(guò)幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波光子激發(fā)熒光,。下面是兩種技術(shù)的對(duì)比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢(shì)：雙光子比共聚焦使用的更長(zhǎng)的波長(zhǎng),，所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達(dá)到250到500微米,，甚至超過(guò)1毫米。另外,，同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā),，所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡非常適合對(duì)細(xì)胞組織進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間在體成像,。進(jìn)口布魯克雙光子顯微鏡圖像對(duì)比度

雙光子顯微鏡大量運(yùn)營(yíng)在實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中,。美國(guó)2PPLUS雙光子顯微鏡價(jià)格

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號(hào)分子其作用具有時(shí)間性和空間性。當(dāng)個(gè)細(xì)胞興奮時(shí),，產(chǎn)生了一個(gè)電沖動(dòng),，此時(shí)，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi),，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì),，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動(dòng),。以此類推,，神經(jīng)信號(hào)便一級(jí)一級(jí)地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)體系,，終形成學(xué)習(xí),、記憶等大腦的高級(jí)功能。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中,，鈣離子同樣扮演著重要的信號(hào)分子的角色,。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時(shí)鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍,，增加的鈣離子對(duì)于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過(guò)程必不可少,。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性,，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定,，同時(shí)也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種,，其中包括電壓門(mén)控鈣離子通道,、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時(shí)受體電位C型通道（TRPC）等,。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過(guò)熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來(lái),，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時(shí)觀察多個(gè)功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞,。美國(guó)2PPLUS雙光子顯微鏡價(jià)格