雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡,，其原理大致是這樣的：首先,，讓我們來(lái)看看什么是熒光顯微鏡。熒光顯微鏡是以紫外線為光源,，照射被檢物體上的熒光物質(zhì)或是熒光染料,，使其發(fā)出熒光,。相比普通光學(xué)顯微鏡,，熒光顯微鏡運(yùn)用了波長(zhǎng)更短的紫外線,，再將可見(jiàn)光過(guò)濾掉,，提高了分辨力率。而當(dāng)被檢物體過(guò)厚時(shí),，從不同深度發(fā)出的熒光都會(huì)打在物鏡上,，使觀察到的像模糊、發(fā)虛,，無(wú)法清楚的知道被檢物體的結(jié)構(gòu),。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，增加了激光掃描裝置,，從而解決了上述問(wèn)題,。激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場(chǎng)光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源,，激光束經(jīng)照明孔,，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上,，對(duì)標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描,。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來(lái)入射光路直接反向回到分光鏡，通過(guò)探測(cè)孔時(shí)先聚焦,，然后被光探頭收集,，轉(zhuǎn)化為信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。這個(gè)裝置能讓通過(guò)探測(cè)***的只有焦平面上發(fā)出的熒光,，使成像更為清晰準(zhǔn)確,，同時(shí)通過(guò)改變物鏡的焦距，能對(duì)不同焦平面進(jìn)行掃描,，通過(guò)計(jì)算機(jī)繪出普通顯微鏡無(wú)法觀測(cè)的三維圖像,。雙光子顯微鏡廠家有哪些？國(guó)外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡光刺激

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小,，重只2.2克,，適于佩戴在小動(dòng)物頭部顱窗上，實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元,、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動(dòng)態(tài)信號(hào),。在大型動(dòng)物上，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴,、多顱窗不同腦區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè),。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學(xué)斷層,、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢(shì),，其橫向分辨率達(dá)到0.65μm,，成像質(zhì)量與商品化大型臺(tái)式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠(yuǎn)優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導(dǎo)的,、美國(guó)腦科學(xué)計(jì)劃重要團(tuán)隊(duì)所研發(fā)的微型化寬場(chǎng)顯微鏡,。采用雙軸對(duì)稱(chēng)高速微機(jī)電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù)，成像幀頻已達(dá)40Hz（256*256像素）,，同時(shí)具備多區(qū)域隨機(jī)掃描和每秒1萬(wàn)線的線掃描能力,。此外，采用自主設(shè)計(jì)可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光纖,，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了微型雙光子顯微鏡對(duì)腦科學(xué)領(lǐng)域較廣泛應(yīng)用的指示神經(jīng)元活動(dòng)的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用,。 同時(shí)采用柔性光纖束進(jìn)行熒光信號(hào)的接收，解決了動(dòng)物的活動(dòng)和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題,。未來(lái),，與光遺傳學(xué)技術(shù)的結(jié)合，可望在結(jié)構(gòu)與功能成像的同時(shí),，精細(xì)地操控神經(jīng)元和神經(jīng)回路的活動(dòng),。布魯克雙光子顯微鏡廠家電話雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被發(fā)動(dòng),，所以雙光子成像更清晰,。

研究人員通過(guò)用不同激光波長(zhǎng)并行化激光掃描（wavelengthmultiplexing），增加了相同時(shí)間內(nèi)可以成像的體積,，并同時(shí)保持較高的時(shí)間和空間分辨率,。通過(guò)引入兩種波長(zhǎng)不同的鈣信號(hào)熒光探針，研究人員將神經(jīng)元群體的活動(dòng)標(biāo)記為兩個(gè)不同顏色,，并同時(shí)用兩個(gè)不同波長(zhǎng)的激光激發(fā)探針,，實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)顏色的并行化數(shù)據(jù)記錄。為了實(shí)現(xiàn)三維空間成像,，研究人員還分別在兩個(gè)激光光路上配置了快速變焦系統(tǒng),，分別為電可調(diào)節(jié)透鏡（electricaltunablelens）和空間光調(diào)制器（spatiallightmodulator）。由此,，可以同時(shí)以10赫茲的速度記錄500微米500微米的10個(gè)平面,，覆蓋縱深達(dá)600微米，涵蓋了從腦皮層第2層到第5層的結(jié)構(gòu),，體積內(nèi)記錄到的神經(jīng)元可以達(dá)到2000個(gè)以上,。

由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度，在我們的實(shí)驗(yàn)中,，時(shí)間分辨率主要是受OPO輸出可見(jiàn)光激光功率的限制。盡管在單點(diǎn)掃描系統(tǒng)中,，v2PE激發(fā)會(huì)使得空間分辨率提高,，但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率,，這主要是多聚焦成像和單點(diǎn)掃描技術(shù)之間的差異造成的。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE,，引入圖像掃描技術(shù)可以進(jìn)一步提高空間分辨率,，這種技術(shù)需要通過(guò)在陣列前引入額外的微透鏡陣列來(lái)實(shí)現(xiàn)。除此之外,，由于可見(jiàn)光區(qū)域的共振效應(yīng),，可能會(huì)產(chǎn)生光漂白，因而為了延長(zhǎng)觀察時(shí)間,，系統(tǒng)還需要對(duì)激發(fā)強(qiáng)度和曝光時(shí)間做進(jìn)一步優(yōu)化,。雙光子顯微鏡大量運(yùn)營(yíng)在實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中；

在該自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡中,，她們將空間光位相調(diào)制器光學(xué)共軛到顯微物鏡的后焦平面,，通過(guò)位相調(diào)制器將入射光分成若干子區(qū)域，每一塊子區(qū)域的波前都可以被控制,。同時(shí),，她們用數(shù)字微陣列光處理器，以不同的頻率同時(shí)調(diào)制其中一半子區(qū)域的入射光強(qiáng)度,，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”,。來(lái)自所有子區(qū)域光束會(huì)在焦點(diǎn)處會(huì)聚干涉，通過(guò)監(jiān)測(cè)焦點(diǎn)激發(fā)的雙光子信號(hào)隨時(shí)間的變化情況,，并進(jìn)行傅里葉變換分析,，可以“分解”得到被調(diào)制的每一塊子區(qū)域的“光線”的貢獻(xiàn)信息，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)一半子區(qū)域波前的并行測(cè)量,。對(duì)另一半子區(qū)域重復(fù)這一測(cè)量過(guò)程,，從而獲得整個(gè)入射波前的信息并進(jìn)行校正。該方法耗時(shí)很短,，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測(cè)量和校正,，無(wú)需復(fù)雜的計(jì)算，適用于任何標(biāo)記密度和標(biāo)記類(lèi)型的樣品,。更重要的是,，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場(chǎng)范圍內(nèi)的成像質(zhì)量。該方法無(wú)疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物,、醫(yī)學(xué)問(wèn)題提供了可行性方案,。雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?國(guó)外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡光刺激

這種雙光子顯微鏡的視場(chǎng)是普通顯微鏡的10倍。國(guó)外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡光刺激

實(shí)驗(yàn)從理論和實(shí)驗(yàn)上評(píng)估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡的空間分辨率,，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對(duì)比,，實(shí)驗(yàn)中v2PE的激發(fā)波長(zhǎng)為521 nm，使用放大倍率為100倍的物鏡,，尺寸為0.6AU,，對(duì)直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測(cè)試性成像,，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177 nm和297 nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率,。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點(diǎn)v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率，模擬計(jì)算顯示v2PE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少,，可以提高空間分辨率。國(guó)外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡光刺激