Itrytoexplainwhytwo-photonmicroscopyhasadeeperimagingdepththanone-photonmicroscopy,intheareaofbiomedicalimaging.Manyofthebiomedicalimagingmodalities,nomatterone-photon(confocal)ormulti-photon(two-photon),uselasersaslightsourceandrequirecompatiblefluorescentdyes.Fluorescentdyeshavetheirownexcitationwavelength,andtheycaneitherbeexcitedbyasinglephotonwiththephotonenergyofthatexcitationwavelength(E=hv=h*c/λ);orbytwophotons,arrivingalmostatthesametime,buteachwithapproximatelyhalfoftheenergy,henceofdoublewavelengththanone-photon(0.5E->2λ).Theformeristheprincipleofone-photonmicroscopyandthelatteristheprincipleoftwo-photonmicroscopy.Whenimagingthesamefluorescentdye,sincetwo-photoncoulduseapproximatelydoubledwavelengthcomparedwithsingle-photon,two-photoncanobviouslypenetrateddeeperintothetissueduetolessscattering(longerwavelength,lessscattering).雙光子顯微鏡非常適合對細(xì)胞組織進行長時間在體成像,。美國熒光雙光子顯微鏡

實驗從理論和實驗上評估了多焦點v2PE顯微鏡的空間分辨率,，并與單光子熒光顯微鏡進行了對比，實驗中v2PE的激發(fā)波長為521 nm,，使用放大倍率為100倍的物鏡,，尺寸為0.6AU,，對直徑100nm的熒光顆粒進行了測試性成像，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像,。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177 nm和297 nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率,，模擬計算顯示v2PE點擴散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率,。國外ultima雙光子顯微鏡成像技術(shù)雙光子顯微鏡不需要共聚焦細(xì)孔,，提高了熒光檢測效率。

在深度組織中以較長時間對活細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達到250到500微米,，甚至超過1毫米。另外,，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像,。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性,。當(dāng)個細(xì)胞興奮時，產(chǎn)生了一個電沖動,，此時,，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi)，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì),，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合,，促使這一級神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動。以此類推,，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去,，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號體系,，終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級功能,。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中,，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM,，而細(xì)胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍,，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少。眾所周知,，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性,，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響,。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種,，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體,、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等,。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來，以反映神經(jīng)元活性,。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞,。微型雙光子顯微鏡的優(yōu)勢是。

宇宙,，浩瀚無垠,，在數(shù)百億光年可觀測的空間里閃爍著上萬億個星系。人類1400克的大腦,如同一個小小的宇宙,，包含了百億級神經(jīng)元和百萬億級的神經(jīng)突觸,，其結(jié)構(gòu)和功能上極其復(fù)雜而精密的連接，涌現(xiàn)出意識和思想--大腦小宇宙隱藏著世界上較佳麗較深邃的奧秘,。新千年伊始,，世界科技強國紛紛啟動有史以來比較大規(guī)模的腦科學(xué)研究計劃，人類探索大腦的波瀾壯闊的歷史畫卷正在展開,。工欲善其事,，必先利其器。目前,，各國腦科學(xué)計劃的一個重要方向就是打造用于全景式解析腦連接圖譜和功能動態(tài)圖譜的研究工具,。其中，如何打破尺度壁壘,，整合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動與大腦整體的活動和個體行為信息,，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用,；雙光子顯微鏡聯(lián)系方式

雙光子顯微鏡能夠在細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞水平上對神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),、離子濃度,、細(xì)胞運動、進行直接成像監(jiān)測,。美國熒光雙光子顯微鏡

雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實例,；生物領(lǐng)域：貝爾實驗室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子動力學(xué)情形。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢,。信息領(lǐng)域：美國科學(xué)家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲存擴展到三維空間,。由于雙光子激發(fā)具有作用精細(xì)體積小的特點，避免了層與層之間的互相干擾,，較大地提高了數(shù)據(jù)儲存密度,。雙光子顯微鏡已延伸到各個領(lǐng)域研究中，它能對樣品進行三維觀察,，其基礎(chǔ)雙光子激發(fā)效應(yīng)也具有極高的應(yīng)用價值,。我們可以相信，隨著科技不斷發(fā)展,，其他技術(shù)的不斷結(jié)合,，雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用。美國熒光雙光子顯微鏡