EndoS糖苷內(nèi)切酶S在抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs）研究中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在糖鏈定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)上。通過上海藥物所的研究,，開發(fā)了一種新穎的糖鏈定點(diǎn)ADC制備策略,，利用EndoS2這種糖苷內(nèi)切酶，可以將小分子細(xì)胞毒藥物“一步”定點(diǎn)連接到抗體的糖基化位點(diǎn),，實(shí)現(xiàn)了糖鏈定點(diǎn)ADC化合物的制備,。定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)相比傳統(tǒng)的隨機(jī)偶聯(lián)具有更好的方法指數(shù)，能夠提高ADC的均一性和穩(wěn)定性,，是當(dāng)前ADC領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,。在抗體的Fc結(jié)構(gòu)域N297位，這是一個(gè)保守的糖基化位點(diǎn),，通過在該位點(diǎn)引入細(xì)胞物質(zhì),，可以形成具有優(yōu)勢(shì)的糖鏈定點(diǎn)ADC化合物（glycosite-specificADCs,gsADCs）。此外,，EndoS2對(duì)多樣化的LacNAc修飾顯示出良好的兼容性,，能夠高效獲得功能修飾的糖工程抗體，并且可以用于抗體的內(nèi)吞成像研究及糖鏈延伸等功能化研究,。研究人員通過這種“一步”制備策略得到的糖鏈定點(diǎn)ADC化合物,，在結(jié)構(gòu)均一性、親水性,、體外穩(wěn)定性以及體外活性方面表現(xiàn)良好,，并且在體內(nèi)瘤抑制活性方面，相比陽性對(duì)照ADC化合物,，在低載藥量的情況下具有更強(qiáng)的抑制效果,。EndoS酶的這些應(yīng)用，不僅展示了其在簡(jiǎn)化ADC制備流程中的潛力,，還有助于推動(dòng)定點(diǎn)ADC藥物的深入發(fā)展,，為未來的生物藥物開發(fā)提供了新的思路和方法。泛素分子可以通過其內(nèi)部的賴氨酸殘基（如Lys48）與其他泛素分子形成多聚泛素鏈,。Recombinant Mouse CD47 Protein,hFc Tag

PreScissionProtease（PSP）是一種由人鼻病毒14型的3C蛋白酶（humanrhinovirus(HRV)type143Cprotease）和GST組成的融合蛋白,。它具有以下特點(diǎn)：1.**特異性識(shí)別**：PreScissionProtease能在低溫下（4°C）特異識(shí)別短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并在Gln和Gly氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切,。2.**依賴結(jié)構(gòu)**：底物的識(shí)別和切割不僅依賴于融合蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu),，還依賴于融合蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。3.**分離GST標(biāo)簽**：它可以特異性的將pGEX-6P系列等載體表達(dá)出的帶有酶底物識(shí)別多肽序列融合蛋白的GST標(biāo)簽進(jìn)行分離,。4.**表達(dá)宿主**：本品由大腸桿菌中重組表達(dá),，并以無菌液體形式提供。5.**物理性質(zhì)**：分子量約為46kDa,，物理外觀為無菌無色液體,。6.**儲(chǔ)存緩沖液**：25mMTris-HCl（pH8.0）,，150mMNaCl，1mMEDTA,，5mMDTT,，50%（V/V）Glycerin。7.**酶切緩沖液**：10×酶切緩沖液為500mMTris-HCl（pH7.0）,，1.5MNaCl,，10mMEDTA，10mMDTT,。8.**純度**：經(jīng)SDS-PAGE及HPLC分析,，純度大于95%。9.**酶活定義**：在5℃條件下反應(yīng)16小時(shí),，能夠切割10μg的GST標(biāo)簽的融合蛋白達(dá)90%以上所需的酶量定義為一個(gè)活性單位,。Recombinant Biotinylated Human KIR2DL2 Protein,His-Avi TagCas9 NLS在Cas9蛋白的N端和C端都含有SV40 T抗原的核定位序列，這使得Cas9與gRNA形成的復(fù)合物,。

確保重組EGFP（增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）在實(shí)驗(yàn)中的穩(wěn)定性和活性,，可以采取以下措施：1.**適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存條件**：重組EGFP通常以凍干粉形式提供，應(yīng)在-20°C至-80°C的低溫條件下儲(chǔ)存,，以保持其穩(wěn)定性,。避免反復(fù)凍融，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞和活性的喪失,。2.**正確的復(fù)溶方法**：在無菌條件下,，使用推薦的溶劑（通常是無菌去離子水或適當(dāng)?shù)木彌_液）復(fù)溶EGFP，并避免使用含有蛋白酶或氧化劑的溶液,。3.**避免光照**：EGFP對(duì)光照敏感,，尤其是在紫外和藍(lán)光下。在處理和儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)避光,，使用遮光容器或在低光照條件下操作,。4.**使用保護(hù)劑**：在某些情況下，添加蛋白穩(wěn)定劑（如甘油,、蔗糖或BSA）可以提高EGFP的穩(wěn)定性,。5.**避免極端pH**：EGFP的活性和穩(wěn)定性可能受到pH值的影響。在實(shí)驗(yàn)中使用接近其等電點(diǎn)pH值的緩沖系統(tǒng),，通常是中性或略偏堿性的條件。6.**控制溫度**：避免將EGFP暴露在極端溫度下,，尤其是在高溫條件下,，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。7.**避免物理剪切力**：在操作過程中,，避免劇烈攪拌或超聲處理,，因?yàn)檫@些可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞,。

NLS-Cas9-EGFPNuclease在基因編輯中提高特異性的策略包括：1.**核定位信號(hào)（NLS）**：NLS有助于Cas9蛋白快速定位到細(xì)胞核，這可以減少Cas9在細(xì)胞質(zhì)中的非特異性結(jié)合,，從而降低脫靶效應(yīng),。2.**瞬時(shí)表達(dá)**：由于NLS-Cas9-EGFPNuclease是作為蛋白質(zhì)直接遞送的，它在細(xì)胞內(nèi)不會(huì)經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá),，這限制了Cas9的活性時(shí)間窗口,，減少了長(zhǎng)時(shí)間存在導(dǎo)致的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。3.**優(yōu)化gRNA設(shè)計(jì)**：精心設(shè)計(jì)的gRNA可以提高特異性,，通過選擇與目標(biāo)基因特異性匹配的gRNA,，可以減少Cas9在非目標(biāo)位點(diǎn)的切割。4.**使用高保真Cas9變體**：一些Cas9變體被設(shè)計(jì)為具有更高的特異性,，通過突變Cas9蛋白的某些氨基酸,，可以降低其在非目標(biāo)位點(diǎn)的活性。5.**熒光標(biāo)記（EGFP）**：EGFP標(biāo)簽不僅用于追蹤和分選,，還可以幫助研究者通過熒光激起細(xì)胞分選（FACS）富集成功編輯的細(xì)胞,，從而提高編輯特異性。6.**體外驗(yàn)證**：在實(shí)際進(jìn)行體內(nèi)基因編輯之前,，可以通過體外DNA切割實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證gRNA的特異性和效率,，篩選出比較好的gRNA。7.**使用PAM序列優(yōu)化**：通過選擇具有限制性PAM序列的gRNA,，可以減少可能的脫靶位點(diǎn),。

PreScissionProtease（PSP）是一種在蛋白質(zhì)純化和分析中使用的酶,，具有以下特點(diǎn)：1.**特異性識(shí)別**：PSP能在低溫（4°C）下特異性識(shí)別八肽序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro或五肽序列Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并在Gln和Gly之間進(jìn)行酶切,。2.**應(yīng)用**：PSP常用于去除融合蛋白中的GlutathioneS-transferase(GST),、His等標(biāo)簽，有助于純化目的蛋白,。3.**純度高**：PSP的純度達(dá)到95%以上,，確保了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。4.**穩(wěn)定性好**：PSP在含有50%甘油的儲(chǔ)存緩沖液中,，-80℃長(zhǎng)期儲(chǔ)存,，有效期2年；小量分裝-20℃保存,，有效期6個(gè)月,。5.**酶活定義**：在5℃條件下反應(yīng)16小時(shí)，能夠切割100μg的GST標(biāo)簽蛋白達(dá)90%以上所需的酶量定義為一個(gè)活性單位,。6.**兼容性強(qiáng)**：PSP的酶切體系中可以兼容1%TritonX-100,、Tween-20或NP-40,，10mMEDTA和500mMNaCl。7.**注意事項(xiàng)**：某些化合物如100mMZnCl2,、4mMAEBSF和100μMChymostatin會(huì)抑制PSP的酶活性50%以上,。8.**優(yōu)化酶切效率**：建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索實(shí)驗(yàn)濃度，實(shí)際操作中,，建議酶用量1:25-1:100U/μg融合蛋白,。泛素連接酶E3識(shí)別特定的靶蛋白，并促進(jìn)E2上的泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白的賴氨酸殘基上,，形成泛素化標(biāo)記,。T4 DNA聚合酶（含dNTPs）

研究表明，優(yōu)化后的Cas12a系統(tǒng)在多種細(xì)胞類型中表現(xiàn)出良好的編輯效率,。Recombinant Mouse CD47 Protein,hFc Tag

重組增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（RecombinantEnhancedGreenFluorescentProtein,EGFP）是一種用于生物科學(xué)研究的工具,。以下是重組EGFP的一些特點(diǎn)和應(yīng)用：1.**高熒光強(qiáng)度**：EGFP比野生型GFP具有更強(qiáng)的熒光，這使得它在成像和檢測(cè)時(shí)更為敏感和有效,。2.**改進(jìn)的折疊效率**：EGFP在生理溫度（如37℃）下的折疊效率更高,，這有助于在細(xì)胞內(nèi)快速形成成熟的熒光蛋白。3.**單一激發(fā)峰**：與野生型GFP相比,，EGFP具有單一的激發(fā)峰,，這簡(jiǎn)化了成像條件的設(shè)置，并提高了信號(hào)的穩(wěn)定性,。4.**適合多種生物系統(tǒng)**：EGFP可以用于多種生物系統(tǒng),，包括細(xì)菌、酵母,、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞,。5.**多功能性**：EGFP可以作為報(bào)告基因用于基因表達(dá)分析，也可以作為融合標(biāo)簽用于蛋白質(zhì)定位和動(dòng)態(tài)研究,。6.**非糖基化**：在大腸桿菌中表達(dá)的重組EGFP是非糖基化的,，這有助于減少翻譯后修飾的復(fù)雜性。7.**純度高**：重組EGFP通常具有高純度,，適合用于各種生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),。8.**穩(wěn)定性**：EGFP的熒光穩(wěn)定性好，適合長(zhǎng)時(shí)間觀察和成像,。9.**分子量**：重組EGFP的分子量約為26.9kDa,，由239個(gè)氨基酸構(gòu)成。Recombinant Mouse CD47 Protein,hFc Tag