細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡介：實(shí)驗(yàn)材料與器材：1,、材料293T細(xì)胞、MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒,、DMEM培養(yǎng)基,、鏈霉素/青霉素(雙抗)、FCS(小牛血清),、PBS(磷酸鹽緩沖溶液),、胰酶/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑(TransFast)2,、器材20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈,、廢液缸、血球計(jì)數(shù)板,、渦旋振蕩器,、恒溫水浴箱、臺(tái)式離心機(jī),、35mm培養(yǎng)皿,、轉(zhuǎn)染管、15ml離心管,、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD,。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法較重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例,，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題,，通過實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,。杭州唐山細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作方法：轉(zhuǎn)染,，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入,，轉(zhuǎn)染目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基本方法,。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑,。電穿孔法,、顯微注射和基因?qū)儆谕ㄟ^物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例；化學(xué)介導(dǎo)方法很多,，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法,、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；生物介導(dǎo)方法,，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,，和現(xiàn)在比較多見的各種細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法,，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高,、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),，是目前轉(zhuǎn)染效率較高的方法,，同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢。但是,，細(xì)菌轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜,，常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及,。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,，則各有其特點(diǎn)重慶細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家現(xiàn)貨使用基質(zhì)珠做為固相支持可以使貼壁細(xì)胞懸浮生長。

轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：用于蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以在添加有血清或無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行,。但更傾向于使用無血清培養(yǎng)基表達(dá)蛋白,，因?yàn)檠宓鞍讜?huì)干擾下游表達(dá)蛋白的純化。無血清培養(yǎng)基一般針對(duì)某一特定細(xì)胞類型優(yōu)化并有幾類無血清培養(yǎng)基不需要添加血清,，一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培養(yǎng)基低得多）,。無蛋白培養(yǎng)基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物，限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基不含有蛋白或未知組成的成分,。多種多樣的配方使您可以選擇較適合您應(yīng)用的一種,。在含血清時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以適應(yīng)無血清培養(yǎng)基，無蛋白培養(yǎng)基或限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基,。在部分情況下（如293-F,，293-H，COS-7和CHO-S）,，對(duì)于已適應(yīng)無血清或無蛋白培養(yǎng)基的細(xì)胞,，可以使用其培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其他一些無血清培養(yǎng)基包含克制陰離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的成分,，在這些情況下,，有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEMⅠ等培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法：磷酸鈣共沉淀原理：該法可用于瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。然而因其對(duì)pH,、溫度和緩沖液鹽濃度的微小變化十分敏感,，所得結(jié)果容易出現(xiàn)差異，且對(duì)許多類型的細(xì)胞培養(yǎng)物(尤其是原代細(xì)胞)具有細(xì)胞毒性,，轉(zhuǎn)染效率較差,。實(shí)驗(yàn)步驟：將核酸與氯化鈣在磷酸鹽緩沖液中混合,，同時(shí)控制好pH、溫度等條件→室溫孵育,，生成濃縮DNA的極小不溶性顆粒沉淀→將顆粒型沉淀分散到細(xì)胞中,，促進(jìn)DNA粘附在細(xì)胞表面→共沉淀通過內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿→分析細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)或者選擇穩(wěn)定性傳染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，外源基因得以表達(dá)但它們并不會(huì)整合到細(xì)胞的基因組中,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染,，你至少要掌握以下幾點(diǎn)：主要有下面幾種方法：：化學(xué)法：磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法,、陽離子脂質(zhì)體法,；物理法：電穿孔法、顯微注射法,、顆粒傳遞法；細(xì)菌介導(dǎo)法：逆轉(zhuǎn)錄細(xì)菌,、腺細(xì)菌A.陽離子脂質(zhì)體法：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞,。特點(diǎn)：簡單通用，適用性廣,，轉(zhuǎn)染效率高,，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清,，轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類型變化大,。由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞，所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高,。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法,。B.電穿孔法：利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾，使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔代細(xì)胞和傳代次數(shù)多的細(xì)胞都不是較佳選擇,。重慶細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家現(xiàn)貨

在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中往往都含有一個(gè)報(bào)告基,。杭州唐山細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑：1.試劑過期有時(shí)候轉(zhuǎn)染效率低下，還要考慮會(huì)不會(huì)存在試劑過期的情況,。毛博當(dāng)年做轉(zhuǎn)染整整半年,，百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn),，原來是Lipofectamine2000過期了,。換了之后，立馬成功,。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn),，盡量使用開封半年內(nèi)的，因?yàn)檫^了半年后,，就算沒有過失效期,，但是細(xì)胞毒性較大增加,，而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢,，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度哈,。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時(shí)加入血清，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡,。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時(shí)換液且換為有血清的培養(yǎng)基,。根據(jù)毛博的經(jīng)驗(yàn)，其實(shí)也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清,。這個(gè)時(shí)候,，較好不要換液，不要打擾細(xì)胞,，讓它安安靜靜地休息,。但是也不能過早加入血清杭州唐山細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑