細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項：細(xì)胞狀態(tài)這點非常重要,，不要急于求成,，一定要讓細(xì)胞處于較佳的生長狀態(tài)再做,。有文獻說傳代不要超過17代。細(xì)胞復(fù)蘇后的3代左右時細(xì)胞狀態(tài)較好,，不要用傳了很多代的細(xì)胞去做,，細(xì)胞的形態(tài)都會發(fā)生變化。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體,，原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細(xì)胞的混合物,。細(xì)胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化,。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化,，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。因此,，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)較佳結(jié)果?；蛘?，幾種來源于經(jīng)篩選，轉(zhuǎn)染效率較高細(xì)胞亞系的細(xì)胞系現(xiàn)在有售對于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的較佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會因細(xì)胞密度而異,。合肥正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑價格

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：(1)轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備A.將400ul去核酸酶水加入管中,，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物,。B.震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,，使用前還需震蕩，,。(2)選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,，再次震蕩。(3)將混合液在室溫放置10—15分鐘,。(4)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。(5)加入混合液,，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時,。(6)到時后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液,，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。合肥正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時,，通過內(nèi)吞作用形成內(nèi)體進入細(xì)胞,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的原理、操作步驟以及小技巧：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟：(1)細(xì)胞培養(yǎng)：取6cm細(xì)胞皿,，向每孔中加入2mL含1~2×105個細(xì)胞培養(yǎng)液,，37℃CO2培養(yǎng)密度至40%~60%，密度過大,，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞,。(2)轉(zhuǎn)染液制備：在EP管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個孔細(xì)胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1ug質(zhì)粒DNA。B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2ul脂質(zhì)體,。分別將A液與B液輕彈混勻,，靜置5分鐘,。(3)吸取B液加入至A液中，輕彈混勻,。室溫中置10-15分鐘,。(4)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用1mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入4mL不含血清培養(yǎng)液,。(5)轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中,，搖勻，37℃溫箱置6~24小時,，吸除無血清轉(zhuǎn)染液,，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。(6)瞬時轉(zhuǎn)染后,，可在48h-72h細(xì)胞長滿之后,，提取細(xì)胞蛋白或者RNA，驗證敲減/過表達效率,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗簡介：實驗原理外源基因進入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法,、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和細(xì)菌介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進入;磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細(xì)胞;細(xì)菌法是利用包裝了外源基因的細(xì)菌傳染細(xì)胞的方法使得其進入細(xì)胞,。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴(yán),、難度較大;細(xì)菌法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對于細(xì)胞有較大影響;所以現(xiàn)在對于很多普通細(xì)胞系,，一般的瞬時轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染為什么不能加血清：不同的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染試劑要求轉(zhuǎn)染的條件是不同的。較好是在靠前次實驗前做一個預(yù)實驗,，比如：HeLa,，293，CHO,，COS7,，MCF－7，HepG2等細(xì)胞,，是否加血清,，對不同的細(xì)胞是有不同的影響的，有些細(xì)胞是可以有血清的,，有些加血清就會受影響,。轉(zhuǎn)染后在6小時左右較好換液且換為有血清的培養(yǎng)基，其一因為普通轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的毒性作用大,，其二可降低因血清的缺乏引起的細(xì)胞的死亡,。轉(zhuǎn)染時不加血清是防止血清的干擾作用，轉(zhuǎn)染后可適時加入。加入過早會引起未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的優(yōu)勢生長,，過晚會引起較多細(xì)胞死亡,。可實時觀察1/5細(xì)胞變圓的時候加入血清脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,。太原正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家

瞬時和穩(wěn)定表達DNA轉(zhuǎn)染后,，轉(zhuǎn)入基因的表達可以在1－4天內(nèi)檢測到。合肥正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑價格

瞬時轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測：基因的瞬時表達在24-72小時內(nèi)就結(jié)束了,。這種快速的瞬時表達非常適用于驗證質(zhì)粒表達和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率,。可以使用報告基因來確定優(yōu)化條件,，其表達蛋白易檢測,，在目的細(xì)胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）,，綠色熒光蛋白（GFP）,，熒光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）?？梢允褂煤唵蔚姆峭凰胤椒z測b-gal的表達以測定轉(zhuǎn)染效率和活性,。pCMVSPORT-bgal質(zhì)粒包含CMV啟動子調(diào)控下的LacZ基因，轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞內(nèi)后可以直接表達bgal,。結(jié)合簡單的檢測步驟,，可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。合肥正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑價格