細胞轉(zhuǎn)染操作方法：轉(zhuǎn)染,，是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入,，轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法,。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑,。電穿孔法,、顯微注射和基因?qū)儆谕ㄟ^物理方法將基因?qū)爰毎姆独换瘜W(xué)介導(dǎo)方法很多,，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法,、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù),；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,，和現(xiàn)在比較多見的各種細菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),。理想細胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高,、細胞毒性小等優(yōu)點,。細菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率較高的方法,，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢,。但是，細菌轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜,，常常對細胞類型有很強的選擇性,，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,，則各有其特點,。代細胞和傳代次數(shù)多的細胞都不是較佳選擇。太原正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑平均價格

細胞轉(zhuǎn)染常用步驟：1.轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中,，震蕩10秒鐘,，溶解脂狀物。②震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存,，使用前還需震蕩,。2.選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細胞,。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,，再次震蕩。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘,。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。5.加入混合液,，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時,。6.到時后，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液,，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時,。貴陽正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑銷售廠家操作簡便，對細胞毒性小,，轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞,。

細胞轉(zhuǎn)染的注意事項：1.細胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對細胞有毒害作用,，細胞太少,，容易死。一般轉(zhuǎn)染時,，貼壁細胞密度為70%-90%,，懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期,。因為轉(zhuǎn)染效率對細胞密度很敏感,，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量,。細胞的融合度必須要達到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白,。CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性。同其他啟動子,，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細菌)相比,，在BHK-21中其活性較高。這三種細菌啟動子在T細胞來源的細胞系,，如Jurkat中組成表達水平較低,。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動Jurkat細胞中CMV啟動子，而單PMA就足以啟動KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動子,。SV40啟動子的表達在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高,，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。

瞬時轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測：基因的瞬時表達在24-72小時內(nèi)就結(jié)束了,。這種快速的瞬時表達非常適用于驗證質(zhì)粒表達和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率,?？梢允褂脠蟾婊騺泶_定優(yōu)化條件，其表達蛋白易檢測,，在目的細胞中不含此蛋白或水平很低,。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP）,，熒光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）,。可以使用簡單的非同位素方法檢測b-gal的表達以測定轉(zhuǎn)染效率和活性,。pCMVSPORT-bgal質(zhì)粒包含CMV啟動子調(diào)控下的LacZ基因,，轉(zhuǎn)染入真核細胞內(nèi)后可以直接表達bgal。結(jié)合簡單的檢測步驟,，可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法,。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。

轉(zhuǎn)染的注意事項：培養(yǎng)基中的物品物品,，比如青霉素和鏈霉素,，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細胞無毒,，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,，使物品可以進入細胞。這降低了細胞的活性,，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低,。所以,，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品,，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用物品。這樣,，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞,。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,，因為這些物品是GENETICIN選擇性物品的競爭性克制劑,。果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復(fù)較佳結(jié)果,。太原正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑平均價格

必須通過對藥物的抗性篩選進行擴增或通過表型變化進行鑒定,。太原正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑平均價格

如何高效率實現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)染：DNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細胞胞漿內(nèi)的DNA不能穿過細胞核的核膜（"核屏障"）。在細胞有絲分裂過程中核膜溶解,，DNA進入細胞核才有可能,。為此，細胞處于分裂期對DNA轉(zhuǎn)染是至關(guān)重要的,，并且處于分裂期的細胞比例必須盡可能大才能實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染,。DNA轉(zhuǎn)染機制示意圖如下所示：轉(zhuǎn)染RNA(siRNA/miRNA/mRNA)對于RNA轉(zhuǎn)染是沒有"核屏障"的,，因為RNA不需要進入細胞核發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，因此細胞分裂對它沒有影響,。轉(zhuǎn)染試劑的選擇理想的轉(zhuǎn)染試劑選擇可以使您的實驗如虎添翼,！真核細胞的先天免疫系統(tǒng)，使它們能夠檢測外來物質(zhì)如脂多糖,、細菌或細菌核酸和蛋白質(zhì),，并克制潛在病原體的入侵。此外,，細胞通過信使分子向臨近細胞傳遞發(fā)現(xiàn)有害物質(zhì)的信號,。因此，這些臨近細胞甚至無需接觸病原體即可采取防御方式,。這種細胞先天免疫系統(tǒng)也是轉(zhuǎn)染成功的一個障礙,。太原正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑平均價格