激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式,，采用激光束作光源,，激光束經(jīng)照明,，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上,，對標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描,。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測***時(shí)先聚焦,，然后被光探頭收集,，轉(zhuǎn)化為信號輸送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理,。這個(gè)裝置能讓通過探測***的只有焦平面上發(fā)出的熒光，使成像更為清晰準(zhǔn)確,，同時(shí)通過改變物鏡的焦距,，能對不同焦平面進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像,。雙光子顯微鏡廠家就找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司,；國外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡用途

王愛民副教授結(jié)合工作實(shí)例，展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應(yīng)用,。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn),，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，重量只為2.2克,，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰,、穩(wěn)定的圖像，該顯微鏡適于佩戴在小動物頭部,，可實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元,、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動態(tài)信號，在大型動物上,，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴,、多顱窗不同腦區(qū)的長時(shí)程觀測。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景,，首先雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像,，在亞微米級成像，此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似,；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r(shí),、在體、原位,、無創(chuàng)地,，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性，區(qū)分成像,；雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行生化指標(biāo)成像,，在無造影劑的前提下，利用自發(fā)熒光,、二次諧波,、熒光獲得活細(xì)胞生化信息。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡光損傷雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡,。

從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對細(xì)胞和組織的光損傷小,，適用于長時(shí)間的研究,；☆穿透能力強(qiáng)：相對于紫外光,，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題,；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收只局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域小：由于激發(fā)只存在于交點(diǎn)處,，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象,；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦）,，這樣就提高了對熒光的收集率,，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長,，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時(shí)的1/16,，明顯降低了散射的干擾；☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性,，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究,；

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測體內(nèi)神經(jīng)元信號，這是揭示動物神經(jīng)活動復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵,。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動,，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快,。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實(shí)現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進(jìn)行成像,，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,，如圖2所示,。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),，其脈沖時(shí)間間隔為2ns,。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像，虛擬源越遠(yuǎn),，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點(diǎn)越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的成像研究。

使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測量不透明大腦深處的活動,；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快,。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實(shí)現(xiàn),，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進(jìn)行成像,，需要較提高2PM的成像速率,。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,，如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),，其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠(yuǎn),，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡,，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。雙光子顯微鏡的應(yīng)用中,，該如何選擇以及更好的使用PMT。美國ultima雙光子顯微鏡光刺激

雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢,？國外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡用途

后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用碘化丙啶(PI)來指示細(xì)胞在7,、8、9和10分鐘的延時(shí)觀察后的損傷情況,，來驗(yàn)證該光學(xué)系統(tǒng)對活細(xì)胞長期觀察的適用性,。在觀察期間，88個(gè)焦點(diǎn)以100毫秒的曝光時(shí)間,，曝光間隔1s照射樣品,，激發(fā)強(qiáng)度為3.21×104W/cm2，激發(fā)波長為525nm,，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑,，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖,，(e)-(h)為相應(yīng)的相應(yīng)襯度圖。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s,，得到相應(yīng)的(i)-(p),。由圖像可知，延時(shí)觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細(xì)胞損傷,，對于實(shí)際3D延時(shí)成像,，由于焦平面是移動的，所以預(yù)期細(xì)胞存活時(shí)間會更長,，可見這是一種在3D在體延時(shí)成像中具有很大優(yōu)勢的成像方案,。國外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡用途

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