Sternand Jean Marx在評論中說：祖家能夠在更為精細的層次研究樹突的功能,，這在以前是完全不可能的,。新的技術(shù)（如腦片的膜片鉗和雙光子顯微使人們對樹突的計算和神經(jīng)信號處理中的作用有了更好的理解,。他們解釋了是樹突模式和形狀多樣性,，及其獨特的電,、及其獨特的電化學特征使神經(jīng)元完成了一系列的專門任務(wù),。雙光子與共聚焦在發(fā)育生物學中的應(yīng)用雙光子∶每2.5分鐘掃描一次,，觀察24小時,，發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦∶每15分鐘掃描一次,，觀察8小時后細胞分裂停止，不能發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦激發(fā)時的細胞存活率為多光子系統(tǒng)的10～20%,。高精度,、低損傷,、高速掃描，多光子顯微鏡為科研工作提供強大支持,。清醒動物多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析

繼首代小型化雙光子顯微鏡在國際上獲得小鼠自由行為過程中大腦神經(jīng)元和突觸的動態(tài)圖像后,，我們成功研制了第二代小型化雙光子顯微鏡。它具有更大的成像視野和三維成像能力,，可以清晰穩(wěn)定地對自由活動小鼠三維腦區(qū)的數(shù)千個神經(jīng)元進行成像,，實現(xiàn)對同一批神經(jīng)元的一個月追蹤記錄。通過對微光學系統(tǒng)的重新設(shè)計系統(tǒng)的,。微物鏡工作距離延長至1mm,，實現(xiàn)無創(chuàng)成像。內(nèi)嵌可拆卸的快速軸向掃描模塊,，可采集深度180微米的3D體成像和多平面快速切換的實時成像,。該掃描模塊由一個快速的電動變焦透鏡和一對中繼透鏡組成，在不同深度成像時可保持放大倍率恒定,。其變焦模塊重量,，研究人員可根據(jù)實驗需求自由拆卸,。此外,，新版微型化成像探頭可整體即時拔插，極大地簡化了實驗操作,，避免了長周期實驗時對動物的干擾,。在重復裝卸探頭同一批神經(jīng)元時，視場旋轉(zhuǎn)角小于,，邊界偏差小于35微米,。清醒動物多光子顯微鏡準確定位與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡具有更好的深度穿透能力和較低光損傷性,，可以觀察更深層的組織結(jié)構(gòu),。

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡具有光學切片和深層成像等功能,，這兩個優(yōu)勢極大地促進了研究者們對于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認識,。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像,、大量神經(jīng)元成像,、高速神經(jīng)元成像這三個方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動與復雜行為聯(lián)系起來,，通常需要對大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進行成像,，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素,，雖然可以通過增加激光強度來解決散射問題,，但這會帶來其他問題,，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā),。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光,。

單光子激發(fā)熒光的過程，就是熒光分子吸收一個光子,，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),，躍遷以后，能量較大的激發(fā)態(tài)分子,，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子,，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級的分子的平均壽命大約在10s左右,。這時它不是通過內(nèi)轉(zhuǎn)換的方式來消耗能量,，回到基態(tài)，而是通過發(fā)射出相應(yīng)的光量子來釋放能量,，回到基態(tài)的各個不同的振動能級時,，就發(fā)射熒光。因為在發(fā)射熒光以前已經(jīng)有一部分能量被消耗,，所以發(fā)射的熒光的能量要比吸收的能量小,，也就是熒光的特征波長要比吸收的特征波長來的長。利用多光子顯微鏡,，進行無損,、高分辨率的生物組織層析成像。

現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進步,，特別是隨著后基因組時代的到來,，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細胞模型，為在體研究基因表達規(guī)律,、分子間的相互作用,、細胞的增殖、細胞信號轉(zhuǎn)導,、誘導分化,、細胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學條件。然而,，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學方法,，已經(jīng)對基因表達和蛋白質(zhì)之間的相互作用進行了深入、細致的研究,，但仍然不能實現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動的實時,、動態(tài)監(jiān)測。在細胞的生理過程中,，基因,、尤其是蛋白質(zhì)的表達,、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的、動態(tài)的變化,。目前的分子生物學方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化,，但獲取這些信息對與研究基因的表達和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要。因此,，發(fā)展能用于,、動態(tài)、實時,、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動的方法是非常必要的,。多光子顯微鏡是一種高分辨率的顯微鏡技術(shù)，利用多光子激發(fā)熒光的原理來觀察生物樣品的細胞結(jié)構(gòu)和功能,。美國布魯克多光子顯微鏡實驗操作

高速掃描和高分辨率的完美結(jié)合,，多光子顯微鏡提高樣品處理速度和精度。清醒動物多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析

2020年,，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置,，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圓柱透鏡將激光束一維聚焦,，會聚角為Δθ,。光束進入到一對幾乎平行的高反射鏡中，其間距為S,，偏角為α,。經(jīng)過反射鏡多次反射后,，激光脈沖被分成多個傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α）,，脈沖間以2S/c的時間延遲（c，光速）回射,。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標準雙光子熒光顯微鏡中,。光源是具有1MHz重復頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns,。這些焦點是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。清醒動物多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析