使用MPM對神經(jīng)元進行成像時,，通過隨機訪問掃描—即激光束在整個視場上的任意選定點上進行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元,，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時間,。隨機訪問掃描可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實現(xiàn),，其原理是將具有一個射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵,，激光束通過光柵時發(fā)生衍射,。通過射頻電信號調(diào)控聲波的強度和頻率從而可以改變衍射光的強度和方向，這樣使用1個AOD就可以實現(xiàn)一維橫向的任意點掃描,，利用1對AOD,，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實現(xiàn)3D的隨機訪問掃描。但是該技術(shù)對樣本的運動很敏感,，易出現(xiàn)運動偽影,。目前，快速光柵掃描即在FOV中進行逐行掃描,，由于利用算法可以輕松解決運動偽影而被普遍的使用,。帶寬足以覆蓋鈦藍寶石激光器的可調(diào)諧范圍和用于多光子顯微鏡的許多其它激光器的典型中心頻率。靈長類多光子顯微鏡Ultima Investigator

某種物質(zhì)能產(chǎn)生熒光，首要條件是分子必須具有吸收的結(jié)構(gòu),，即生色團（分子中具有吸收特征頻率的光能的基團）,。其次，該物質(zhì)必須具有一定的量子產(chǎn)率和適宣的環(huán)境,。我們把分子中發(fā)射熒光的基團稱為熒光團,。熒光團一定是生色團，但生色團不一定是熒光團,。因為,，如果生色團的量子產(chǎn)率等于零，就不能發(fā)射出熒光,，處于激發(fā)態(tài)的分子,，可以由許多方式（如熱，碰撞）把能量釋放出來,，發(fā)射熒光只是其中的一種方式,。此外，一種物質(zhì)吸收光的能力及量子產(chǎn)率又與物質(zhì)所處的環(huán)境密切相關(guān),。多光子顯微鏡設(shè)備顯微鏡簡史：從光到多光子顯微鏡,。

比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出，基于分子光學(xué)標(biāo)記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢,。例如,，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實現(xiàn)對分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm,，時間分辨率;分鐘量級,。與PET比較，光學(xué)成像的應(yīng)用場合更廣（可測量更多的參數(shù),，請參見表1-1）,，且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米,。因此,，二者相比，雖然光學(xué)成像在測量深度方面不及PET,，但在測量參數(shù)種類與時空分辨率方面有一定優(yōu)勢,。對于小動物（如小白鼠）研究來說，光學(xué)成像技術(shù)可以實現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達成像,。例如,，初步研究表明，熒光介導(dǎo)層析成像可達到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達的實時在體成像,。

通過添加FACED模塊,，可以將基于標(biāo)準(zhǔn)振鏡的現(xiàn)有2PM輕松轉(zhuǎn)換為千赫茲成像系統(tǒng),。FACED雙光子熒光顯微鏡遵循光柵掃描，需要很少的計算處理,，在稀疏或密集的標(biāo)記樣本中均可以使用,，并且不受串?dāng)_的影響，而且對整個圖像平面采樣后可以進行運動校正,。實驗中沒有觀察到光損傷的跡象,，此外，子脈沖延遲到達相同的樣品位置,，能為熒光團提供充足的時間使其從易于破壞的暗態(tài)返回到基態(tài),，可以明顯減少光漂白。使用現(xiàn)有的傳感器,，F(xiàn)ACED雙光子熒光顯微鏡可以提供足夠的速度和靈敏度來檢測神經(jīng)元過程中的鈣瞬變和谷氨酸瞬變,，以及來自細(xì)胞體的尖峰和亞閾值電壓。該組使用基于FACED的2PM顯微鏡,，在小鼠大腦中實現(xiàn)了千赫茲速率的神經(jīng)活動成像,。在物鏡平均激光功率為10-85mW下，他們測量了清醒小鼠中V1神經(jīng)元的自發(fā)性和感覺誘發(fā)性的超閾值和亞閾值電位活動,。多光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。

單光子激發(fā)熒光的過程,，就是熒光分子吸收一個光子,，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后,，能量較大的激發(fā)態(tài)分子,，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級,。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級的分子的平均壽命大約在 10s 左右,。這時它不是通過內(nèi)轉(zhuǎn)換的方式來消耗能量，回到基態(tài),，而是通過發(fā)射出相應(yīng)的光量子來釋放能量,，回到基態(tài)的各個不同的振動能級時，就發(fā)射熒光,。因為在發(fā)射熒光以前已經(jīng)有一部分能量被消耗,，所以發(fā)射的熒光的能量要比吸收的能量小，也就是熒光的特征波長要比吸收的特征波長來的長,。多光子顯微鏡中,，極短的激光脈沖聚焦在樣品上的緊密點上，激發(fā)熒光團產(chǎn)生圖像,。美國在體多光子顯微鏡作用

多光子顯微鏡在基礎(chǔ)科學(xué)和臨床診斷領(lǐng)域的應(yīng)用范圍正在持續(xù)增長,。靈長類多光子顯微鏡Ultima Investigator

當(dāng)激光光束焦點的位置在鏡面上,，此時被反射的激光在無限空間中成為準(zhǔn)直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一個激光光斑,。同理,，如果橫向掃描光束，則會形成遠離傾斜鏡鏡面的焦點,，這又導(dǎo)致返回的光束會聚或發(fā)散,，進而OBJ2能在軸向不同位置形成焦點，通過這種方式即能實現(xiàn)連續(xù)的軸向掃描,。對于較小的傾斜角,，聚焦沒有球差。該組在實驗中表征了這種將橫向掃描轉(zhuǎn)換為軸向掃描技術(shù)的光學(xué)性能,，并使用它將光片顯微鏡的成像速度提升了一個數(shù)量級,，從而可以在三個維度上量化快速的囊泡動力學(xué)。該組還演示了使用雙光子光柵掃描顯微鏡以12 kHz進行共振遠程聚焦,，該技術(shù)可對大腦組織和斑馬魚心臟動力學(xué)進行快速成像,，并具有衍射極限的分辨率。 靈長類多光子顯微鏡Ultima Investigator