Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經元成像,，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經元的感官刺激誘導樹突鈣離子動態(tài)后，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯,。值得一提的是,，霍華德·休斯醫(yī)學院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強大的多光子介觀顯微鏡，其成像視場達到5毫米,，能夠跨多個腦區(qū)進行高速功能成像,。根據(jù)清華大學單一采購來源的**指導意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍。30年來,，雙光子顯微鏡已成為較厚生物組織三維成像中不可或缺的工具。從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。下圖統(tǒng)計了自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量,，發(fā)展速度可見一斑,。成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調焦設備。熒光雙光子顯微鏡圖像對比度

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細胞分辨率下監(jiān)測體內神經元信號,，這是揭示動物神經活動復雜機制的關鍵,。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動,；成像膜電壓變化能直接反映神經元活動,，但神經元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn),，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進行成像,，需要較提高2PM的成像速率,。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標準雙光子熒光顯微鏡中,，如圖2所示,。光源是具有1MHz重復頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產生80個脈沖焦點,，其脈沖時間間隔為2ns,。這些焦點是虛擬源的圖像，虛擬源越遠,，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡,，從而導致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm。國內ultima雙光子顯微鏡成像原理是什么雙光子顯微鏡廠家就找滔博生物,。

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小,，重只2.2克，適于佩戴在小動物頭部顱窗上,，實時記錄數(shù)十個神經元,、上千個神經突觸的動態(tài)信號。在大型動物上,，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴,、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測。相比單光子激發(fā),，雙光子激發(fā)具有良好的光學斷層,、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢，其橫向分辨率達到0.65μm,，成像質量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美,，遠優(yōu)于目前領域內主導的、美國腦科學計劃重要團隊所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡,。采用雙軸對稱高速微機電系統(tǒng)轉鏡掃描技術,，成像幀頻已達40Hz（256*256像素），同時具備多區(qū)域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力,。此外,，采用自主設計可傳導920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統(tǒng)實現(xiàn)了微型雙光子顯微鏡對腦科學領域較廣泛應用的指示神經元活動的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用,。 同時采用柔性光纖束進行熒光信號的接收,，解決了動物的活動和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來,，與光遺傳學技術的結合,，可望在結構與功能成像的同時，精細地操控神經元和神經回路的活動,。

雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新技術,。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經過一個很短激發(fā)態(tài)后,，發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。因其光損傷小、樣本透射深等優(yōu)勢,，使得觀察熒光細胞成為可能,。中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所-雙光子顯微鏡成像平臺借助于雙光子顯微鏡成像技術及不同轉基因小鼠開展對多種臟器的***成像研究。以小鼠顱內***成像為優(yōu)勢,，可動態(tài)**觀察小鼠顱內神經細胞,、小膠質細胞/巨噬細胞、周細胞,、血管,、轉移瘤細胞、膠質瘤細胞等的變化情況,，在**學,、神經生物學、發(fā)育生物學,、神經退行性疾病等領域具有廣泛應用,。小鼠其它組織臟器，如脾,、肺,、顱骨、股骨,、胸骨等也可借助本平臺進行成像研究,。顯微成像技術包含：雙光子顯微鏡、寬場熒光顯微鏡,、共聚焦顯微鏡,、全內反射熒光顯微鏡等多種成像方式。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像,，雙光子顯微鏡是當前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術的對比圖,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達到250到500微米,，甚至超過1毫米。另外,，同時吸收兩個光子意味只有較強度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像,。雙光子顯微鏡除了可以進行厚的組織樣品拍攝以外呢,，可以在小鼠的的任何部位進行成像。國內激光熒光雙光子顯微鏡光毒性

雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點,，那么雙光子顯微鏡有哪些應用呢,？熒光雙光子顯微鏡圖像對比度

激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源,，激光束經照明,，經由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上,，對標本焦平面上每一點進行掃描,。組織樣品中的熒光物質受到刺激后發(fā)出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測時先聚焦,，然后被光探頭收集,，轉化為信號輸送到計算機進行處理。這個裝置能讓通過探測的只有焦平面上發(fā)出的熒光,，使成像更為清晰準確,，同時通過改變物鏡的焦距，能對不同焦平面進行掃描,，通過計算機繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像,。而配合了雙光子激發(fā)技術，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效,。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術呢？在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,，經過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）,。利用這個原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術。熒光雙光子顯微鏡圖像對比度